Objectif : séparer et identifier les protéines d'un mélange par une des techniques d'électrophorèse pouvant être mise en oeuvre au laboratoire.

Parmi les supports utilisés pour l'électrophorèse, on trouve :
- le papier pour la séparation de petites molécules comme les acides aminés ; 
- l’acétate de cellulose pour la séparation des protéinestte activité ;
- les milieux gélifiés comme l’agarose, l’amidon… pour la séparation des grandes molécules d’ADN, de protéines ou lipoprotéines ;
- les gels de polyacrylamide et de polyvinyle, pour la séparation très fine de protéines et d’acides nucléiques (nouveauté 2024, à venir).

Séparation et identification de protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (à venir mars/avrli 2024)

Séparation et identification de protéines sériques par électrophorèse sur gel d’agarose prêt à l'emploi (Helena SAS MX) : plus utilisé

Source photo protéinogramme : Claire Mottet

Séparation et identification de protéines de différents mélanges par électrophorèse sur gel d’agarose coulé au laboratoire (fiche à télécharger)

• préparation d'un gel d'agarose à 1 % (m/V) ;
• préparation des solutions de dépôt : solutions étalon d'ovalbumine, de caséine, de lysozyme et de différents milieux biologiques complété avec du tampon de charge (bleu de bromophénol pour suivre la migration et saccharose ou glycérol comme alourdisseur) : voir photo
• électrophorèse à voltage constant pendant 1 h en tampon TBE (Tris Borate EDTA) pH 8,6 : voir photo
• révélation des protéines:
  • au rouge Ponceau ;
  • au bleu de Coomassie, qui se fixe, par des liaisons faibles, aux acides aromatiques (phénylalanine, tyrosine, tryoptophane)

Comparaison de deux méthodes de révélation des protéines : au rouge Ponceau et au bleu de Coomassie : quelle conclusion tirer ?

• Le rouge Ponceau est peu sensible, il se décolore avec le temps, n'est pas facile à photographier (le contraste entre les bandes colorées et le reste du gel est difficile à photogaphier, sauf si l'on dispose d'un scanner dédié). 
• le bleu de Coomassie est plus sensible,  la coloration est irréversible. 

Electrophorégramme après révélation au bleu de Coomassie

Remarque : la qualité réelle est supérieure au rendu photo ; une image de qualité nécessite un scanner spécialisé dans la numérisation des gels d'électrophorèse ; un tel scanner équipera prochainement notre laboratoire.

Edit mai 2016 : le scanner (Biorad Geldoc EZ) est arrivé.
Le gel avait été conservé depuis durant 8 mois à 4 °C, emballé dans du film cellophane et imprégné de tampon TBE 1X puis a été scanné :

Légendes des dépôts :

1. solution étalon d'ovalbumine
2. solution étalon de lysozyme
3. solution étalon de caséine
4. blanc d'oeuf
5. salive
6. cachet de Maxilase préalablement dissout
7. lait UHT écrémé
8. blanc d'oeuf dilué au 1/10
9. solution étalon d'ovalbumine
10. solution étalon de lysozyme

• Quelles conclusions tirer :
  - concernant la composition qualitative des milieux biologiques testés (salive, blanc d'oeuf, lait UHT) ?
  - concernant la charge globale, et donc le pHi (pH pour lequel une molécule est sous forme d'ion mixte ou swittertion) comparé au pH du tampon), de chaque protéine étalon ?

Séparation et identification de protéines sériques par électrophorèse sur bande d'acétate de cellullose

Objectif : réaliser une séparation électrophorétique des protéines sériques suivi d'une analyse numérique afin d'établir le profil électrophorétique du sérum d'un patient.

Une analyse sanguine comprend de nombreux examens et paramètres :
- L’hémogramme ou Numération de la Formule Sanguine (NFS) : numération des hématies, plaquettes et leucocytes (cf. AT de première : Frottis sanguin et formule leucocytaire), hématocrite, taux d’hémoglobine.
- Le bilan lipidique : taux de triglycérides, de cholestérol… (cf. AT de terminale : Les enzymes dans le diagnostic médical).
- Le bilan glycémique : glycémie à jeun  (cf.AT de terminale : Dosage chimique vs enzymatique : mise en évidence de la spécificité enzymatique).
- Le bilan de la fonction rénale : dosage de la créatine et de l’urée dans le plasma.
- Le bilan hépatique : dosage d’enzymes sanguines (cf. AT de terminale : Les enzymes dans le diagnostic médical).
- Le bilan de la coagulation sanguine.
- Un dosage des protéines (cf. AT de première : Dosage des protéines par la méthode du biuret).
- Une analyse semi-quantitative par comparaison des différentes classes de protéines après électrophorèse : technique d’analyse et de fractionnement basée sur la migration différentielle de molécules chargées (ions, macromolécules, particules) sous l’action d’un champ électrique. Chaque molécule se déplace à une vitesse qui lui est propre, vers le pôle de signe opposé à sa charge
Ces examens permettent de déceler ou diagnostiquer de nombreuses pathologies

Composition du sérum humain en protéine
La protidémie ou protéinémie (concentration en protéines dans le sang) usuelle varie de 65 à 80 g·L^-1.
Les protéines du plasma sont classées en deux fractions :
- La sérum-albumine : elle intervient dans la pression osmotique plasmatique, lors du transport des acides gras, des médicaments, des hormones thyroïdiennes…
- Les globulines : sont elles-mêmes réparties en trois groupes :
     > les α-globulines (ex : l’α2 macroglobuline) pour la plupart impliquées dans le processus inflammatoire qui est une réaction de défense.
     > les β-globulines (ex : le fibrinogène, protéine globulaire se transformant en protéine fibreuse nommée fibrine au cours du phénomène de coagulation).
     > les γ-globulines : ce sont les immunoglobulines M, G, D, E et A, également appelés anticorps.

Ces protéines ont les caractéristiques présentées ci-dessous :

[1] Le pHi (ou pH isoélectrique) est le pH pour lequel une molécule possédant des fonctions ionisées ne migre pas dans un champ électrique.
-Lorsque le pH du milieu est inférieur au pHi de la molécule, celle-ci est chargée positivement.
-Lorsque le pH du milieu est supérieur au pHi de la molécule, celle-ci est chargée négativement.
 

Tutoriel : établir un diagramme d’ionisation d'acide aminé

• À l’aide des informations précédentes :

• Relever les noms et rôles des protéines sériques.

• Calculer le pourcentage  de chaque classe de protéines par rapport aux protéines sériques totales.

• Indiquer quelle sera la charge électrique de chaque classe de protéine dans une solution tampon à pH 8,6. Argumener la réponse.

• En déduire à quel endroit doit être déposé le sérum sur la bande d'acétate de cellulose : (côté pole négatif ou cathode, centre, ou côté pole positif ou anode ?
  (cf. fiche technique "Réaliser une électrophorèse de protéines sur acétate").

• Prévoir, à l’aide de la fiche technique et des informations précédentes, le sens et l’ordre de migration des différentes protéines du sérum sachant que :
  - une protéine est d’autant plus chargée que le pH du milieu est éloigné du pHi de la protéine
  - plus une protéine est chargée, plus elle se déplacera rapidement dans un champ électrique.

L'électrophorèse se fait à partir d'un sérum humain : 
Différence entre sérum et plasma.

A partir de ce document :

• Indiquer toutes les étapes nécessaires à l'obtention :
  - d'un sérum humain
  - d'un plasma humain

• Rédiger une analyse des risques liées à la manipulation du sang : danger, nature du risque, voies d'exposition, situations exposantes au danger, événement dangereux, mesures de prévention collectives et individuelles

Remarque ; l'intégralité de cette manipulation est réalisée en démonstration par l'enseignant.

Vidéo d'une électrophorèse des protéines sériques sur acétate de cellulose dans le cadre d'une analyse médicale :

Le schéma du montage, avc comme support une bande d'acétate de cellulose, est le suivant :

Les échantillons soumis à électrophorèse sont incolores. C’est pourquoi l’électrophorégramme doit être coloré à l’issue de la migration. Le colorant ne dépend pas de la technique utilisée, mais de la nature des échantillons à analyser :
- les protéines peuvent être révélées par le rouge Ponceau ou le bleu de Coomassie ;
- l’ADN peut être révélé par des agents intercalants comme le SYBR Green ou le GelRed.

Voici le protéinigramme obtenu, avant transparisation :

• Réaliser un densitogramme à partir de l'électrophorégramme en utilisant le tutoriel "MESURIM sur protéinogramme"

• Créer un document numérique renfermant, sur une seule page :
  - l’électrophorégramme
  - le densitogramme obtenu après traitement 
  Pour ce faire, réaliser des copies écran, les coller sur un document texte en respectant les proportions (touche shift maintenue lors du redimensionnement de l'image) et en alignant les deux images l'une au-dessus de l'autre.
• Imprimer un document comportant le densitogramme et.

• Identifier sur chacun des deux documents les protéines sériques.

• Utiliser les valeurs du densitogramme pour comparer le pourcentage en protéines du sérum analysé avec les valeurs classiquement trouvées chez les sujets sains.

• Indiquer si le sérum analysé présente une pathologie liée à un déséquilibre protéique.    

Exemple de protéinogramme de meilleure qualité (source : Jeulin)