Le dosage ou la recherche de biomolécules peut être basé :
- sur des méthodes chimiques (activités de 1^ère : dosage des protéines par la réaction du biuret, dosage des glucides réducteurs par le DNS)
- sur des méthodes enzymatiques (activités de 1^ère : recherche des activités phosphatase et peroxydase du lait)

Objectifs :

• Vérifier une hypothèse émise lors d'une activité documentaire sur la specificité enzymatique, basées sur l'observation des structures moléculaires des enzymes : le DNS permet de doser tous les glucides possédant une fonction réductrice libre alors que la glucose oxydase (GOD) ne permet que le dosage du glucose (spécificitié de substrat étroite)
• Comparer la sensibilité d’un dosage chimique avec un dosage enzymatique (nous réduirons notre approche à un système linéaire dans lequel la sortie est proportionnelle à l'entrée ; on déterminera donc la sensibilité des deux méthodes simplement en calculant la pente selon l'équation générale suivante : 

 : indication donnée par l'essai

 : quantité de grandeur à mesurer

Pour ce faire, l’enzyme « glucose oxydase » est utilisée pour doser différents glucides, en comparaison avec un dosage par colorimétrie avec un réactif contenant de l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS)

Un exemple d'application

 

Dosage chimique des glucides réducteurs par le DNS avec une gamme étalon

• Quatre solutions de glucides sont dosées par le DNS :
  - solution de glucose,
  - de fructose,
  - de saccharose
  - de saccharose préalablement hydrolysé
  toutes à une concentration en masse de 1,00 g.L^-1

• Deux solutions étalon sont utilisées pour réaliser la gamme d'étalonnage : solution de glucose ou solution de fructose.

Réaliser une analyse a priori des risques liés aux procédures opératoires :

Recopier et compléter le tableau de manipulation :

Expliquer comment a été déterminée la longueur d’onde de 540 nm pour ce dosage.

Voici l'extrait d'un tableur d'exploitation (image de résolution plus élevée que celle ci-dessous) de valeurs mesurées et calculées

Exercice : avec les informations fournies sur l'image précédente 

Tracer les droites d’étalonnage : A_{à 540 nm contre blanc réactif} = f(ρ_{(glucose ; tube)} en g·L^-1 et les valider.

Calculer les paramètres pour chaque droite d'étalonnage (coefficient directeur, ordonnée à l'origine, coefficient de détermination R²). 

Expliquer pourquoi une valeur de la gamme numéro 3 est surlignée en jaune.

Indiquer quelles sont les droites d'étalonnage qui peuvent être directement validées.
Donbée : on considère la régression satisfaisante si le coefficient de détermination R² est supérieur à 0,995.

Commenter les indications d'absorbance relevées sur le spectrophotomètre et les concentrations en masse de glucides calculées d'après les paramètres de la droite.

Rechercher si chacun des glucides testé est réducteur ou non réducteur.

Calculer les concentrations en masse de glucides dans chaque expérience réalisée et vérifier la concordance avec la valeur fournie.

Justifier le choix des solutions étalons utilisées pour réaliser la gamme.

Comparer la sensibilité de la méthode sur la gamme de glucose et sur la gamme de fructose. Observe-t-on une différence ?

Vérifier l’acceptabilité de mesure à l’aide de l’étalon de contrôle (attention : tenir compte de sa dilution éventuelle).

Utiliser le logigramme pour déterminer si les valeurs mesurées sont compatibles.

Données : s_r ρ_{(glc ; solution glucides)}  = 84 mg.L^-1                          M_glucose = 180 g.mol^-1 

 

Dosage par la glucose oxydase à l'aide d'un étalon

Voici un résumé annoté de la notice fournie par la société Bio Mérieux concernant le kit de dosage "Glucose RTU".

Lors d'un dosage enzymatique il faut toujours se poser les questions suivantes (et y répondre bien sur !) :

Que dose-t-on :
- un substrat ?
- une activité enzymatique ?

Par quelle méthode :
- point final ?
- cinétique continue ou par points ?
- cinétique 2 points ?

Quelle est la réaction principale (celle dans laquelle intervient le substrat) ?

Quelle est la réaction indicatrice (celle qui fait apparaître ou disparaitre la molécule qui a des propriétés analytiques) ?

Quelle est la réaction intermédiaire (si il y en a une) ?

Quelles sont les conditions opératoires:
- rôle de la température de pré-incubation (si elle est présente)
- rôle de la température d'incubation,
- pH,
- molécules en concentration  limitantes ou en excès,
- rôle des constituants

Comment est déterminée la longueur d'onde du dosage ?
Remarque : la plupart des réponses peuvent être trouvées par la simple analyse de la notice, mais des connaissances théoriques sont évidemment indispensables pour comprendre et argumenter.

Montrer que l'équation proposée pour le calcul de la concentration en masse de  glucose dans l’échantillon est correcte :

De gauche à droite : 
1) blanc réactif : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres eau distillée
2) étalon : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres de solution étalon de glucose à 1,00 g.L^-1 (soit 5,6 mmol.L^-1)
3) contrôle : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres de solution contrôle de glucose à 0,93 g.L^-1 (soit 4,4 mmol.L^-1)
4) essai glucose : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres de solution de glucose à doser
5) essai fructose : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres de solution de fructose à doser

Exemples de valeurs obtenues pour ce dosage :

blanc réactif	étalon glucose	contrôle glucose	solution de glucose à doser	solution de fructose à doser
0,000	0,238	0,203	0,145	0,003

Calculer la concentration en quantité de matière de glucose dans la solution de contrôle C, en mol.L^-1.

Vérifier l’exactitude de mesure de la concentration molaire en glucose dans la solution contrôle C en utilisant l'aide-mémoire de métrologie (ci-dessous)

Valider (ou non) l'exécution de la procédure dans les conditions opératoires du jour.

Données : Intervalle d’acceptabilité des mesures du contrôle : [3,8⋅10 ^-3 mol·L^-1 ; 5,0⋅10^-3  mol·L^-1]

Calculer les concentrations en quantité de matière de glucose dans :
- la solution de fructose à doser
- la solution de glucose à doser

Utiliser le logigramme pour déterminer si les valeurs mesurées sont compatibles.

Les valeurs sont-elles conformes aux hypothèses faites en début de séance ?

Comparer les structures du glucose et du fructose et indiquer ce que sont ces deux molécules l’une par rapport à l’autre.

Commenter la valeur obtenue pour la solution de fructose.

Que peut-on conclure quant à la spécificité de la glucose oxydase ?

Rechercher sur internet ce qu’aurait donné ce dosage fait avec le DNS.

La "difficulté" consiste à calculer la concentration du glucose dans la cuve "Dosage" à l'aide :

• de l'absorbance mesurée pour la cuve dosage
• de l'absorbance mesurée de la cuve "Etalon"
• de la concentration connue avec exactitude de l'étalon.

L'erreur classique est de réaliser un produit en croix, ce qui mène à une équation aux grandeurs erronée, et donc à une valeur fausse.

La démonstration (tutoriel au format .exe) pour arriver à la bonne équation est la suivante : concentration à l'aide d'un seul étalon.

Par ailleurs, lorsqu'on travaillle avec un seul étalon, il faut systématiquement aussi un étalon de contrôle interne (de concentration différente de l'étalon utilisé précédemment), utilisé comme indiqué ci-dessous (extrait du document "Aide-mémoire de métrologie") :