Objectif : établir le profil de sensibilité d'une bactérie à différents antibiotiques par détermination de leurs concentrations minimales inhibitrices (CMI) :
-par la méthode de diffusion en milieu gélosé (antibiogramme standard) qui permet de déterminer approximativement la CMI ;
-par la méthode dilution en milieu liquide, qui permet de déterminer plus finement la valeur de la CMI.

Les antibiotiques sont des substances chimiques naturelles ou de synthèse utilisées pour traiter les infections bactériennes.
Ils fonctionnent :
-soit en inhibant la croissance de la bactérie = effet bactériostatique,
-soit en tuant tout ou partie de la population bactérienne = effet bactéricide.
Au sens strict, Ils ne sont pas efficaces contre d'autres micro-organismes comme les virus ou les mycètes, pour lesquels on emploie des antiviraux ou des antifungiques.

La découverte des antibiotiques a été une avancée médicale majeure qui a permis de sauver des millions de vies en traitant des infections jusque-là incurables : tuberculose, pneumonie, septicémie... Toutefois, ces bénéfices sont depuis de longues années déjà menacés par le développement de mécanismes de résistance des bactéries aux antibiotiques. L’émergence de bactéries multi-résistantes, causée notamment par la surconsommation des antibiotiques, fait craindre que, d’ici à 2050, ces mêmes maladies redeviennent la première cause de mortalité dans le monde.

L'étude des antibiotiques est réalisée au cours de diverses activités :

-Intoxications alimentaires
-Examen CytoBactériologique d'une Urine

Découvrir les modes d’action et spectres d’action des antibiotiques

Un antibiotique doit agir uniquement sur une catégorie de micro-organismes. Cette toxicité sélective est directement liée à leur mode d’action, spécifique de certaines structures cellulaires. Ceci explique leur innocuité vis-à-vis des virus qui ne sont pas des cellules.

Chaque antibiotique a un spectre d’activité, c’est-à-dire un groupe de bactéries contre lesquelles il est efficace. Le spectre d’activité dépend de la résistance naturelle des espèces, il ne tient pas compte des résistances acquises, mutations chromosomiques ou acquisition de plasmides, d’où la nécessité de réaliser un antibiogramme pour les souches isolées de produits pathologiques.

L'antibiogramme standard (fiche technique à télécharger)

Définir les termes suivants : bactériostatique, bactéricide, antibiotique à large spectre, antibiotique à spectre étroit.

Donner un sens à l'expression « faire un usage adapté des antibiotiques".

Proposer des avantages de la méthode d'étalement de la bactérie à tester par écouvillonnage par rapport à l’ancienne méthode par inondation de la gélose (qui consistait à verser plusieurs mL de suspension sur la gélose, puis à aspirer à la pipette Pasteur l’excès de suspension et le verser dans de la Javel).

Rechercher deux critères de standardisation de cette méthode (cf. fiche technique de l'antibiogramme standard).

Donner la signification de l'acronyme CMI et définir la notion de CMI.

Rechercher le sens des termes suivants :
- concentration critique inférieure (CCI)
- concentration critique supérieure (CCS)

La photo suivante présente le résultat d'un antibiogamme en milieu gélosé (méthode de diffusion à partir de disques) réalisé par un élève de terminale dans le cadre de son projet technologique (bactérie testée = Micrococus luteus)
- un disque imprégné d'eau distillée stérile (en haut)
- un disque commercial pré-imprégné d'amoxicilline
- un disque imprégné de 30 µL d'une solution d'antibiotique périmé 

Indiquer le rôle du disque imprégné d'eau et du disque pré-imprégné d'amoxicilline

Rédiger un schéma indiquant où se situent :
a) la zone d'inhibition de la culture
b) la culture bactérienne.

La concentration de l'antibiotique AMX (amoxicilline) dans le milieu gélosé, est-elle la même  (cf. fiche technique de l'antibiogramme standard)
a) près du disque et à un centimètre du disque ? Justifier.
b) juste avant et juste après la zone limite de croissance de la bactérie ? Justifier.

Indiquer où est située la concentration minimale inhibitrice de l'antibiotique AMX.

Indiquer comment comparer la CMI et les concentrations critiques supérieure CCS  et inférieure CCI pour déterminer si une souche est résistante, sensible ou intermédiaire vis-à-vis d’un antibiotique  (cf. fiche technique de l'antibiogramme standard).  

Indiquer ensuite la relation existant entre les diamètres d’inhibition et la sensibilité de la bactérie vis à vis de l’antibiotique  (cf. fiche technique de l'antibiogramme standard).

Compléter le tableau suivant à l'aide de l’extrait du document de la CA-SFM (source : https://www.sfm-microbiologie.org/wp-content/uploads/2023/06/CASFM2023_V1.0.pdf 

Conclure en indiquant le ou les antibiotiques qui pourront être utilisés en thérapeutique. Justifier la réponse.

Détermination de la CMI en milieu liquide (fiche technique à télécharger)

Préparation de l’inoculum : on dispose d’un bouillon de culture d’une souche bactérienne, que l’on souhaite diluer dans du bouillon Mueller-Hinton.
Pour cela  on dispose d’un tube de bouillon Mueller-Hinton de 20 mL et de pipettes graduée de 1mL.

Compte tenu de ce matériel disponible, indiquer comment diluer au 1/100^ème le bouillon de départ 

• Moyens
  • tubes à hémolyse stériles ;
  • pipettes stériles de 1 mL ;
  • tubes de 20 mL de milieu Mueller-Hinton stérile ;
  • solution de pénicilline à 0,5 g · L^-1 ;
  • GNO en boite de Pétri ;
  • vortex ;
  • bouillon d’Enterococcus faecalis ;

• Préparation de l'inoculum : diluer le bouillon de culture de la souche au 1/100 dans un tube de 20 mL de milieu Mueller-Hinton.
• Gamme de dilution de l'antibiotique : réaliser la gamme de dilution précédemment établie.
• Ensemencement : ajouter 1 mL de l'inoculum dans chaque tube de la gamme de dilution.
• Vérification de la pureté de la suspension fournie : réaliser un isolement sur GNO
• Incubation : 24 heures à 37°C en atmosphère aérobie.
• Vérification de la pureté de la suspension fournie : effectuer la lecture macroscopique de l’isolement sur GNO.
• Détermination de la CMI : présenter les résultats sous forme de tableau (compléter celui fait en jour 1) en indiquant :
  • « + » : culture
  • « - » : absence de culture.

On réalise une gamme de dilution d’un antibiotique (la pénicilline) ; pour cela on suit le protocole suivant : gamme de dilution de l'antibiotique

Rédiger un schéma de la procédure opéatoire. 

Lorsque la gamme de dilution est réalisée, on ajoute 1 mL de souche bactérienne diluée (inoculum) dans chaque tube précédemment réalisé (volume final de chaque tube = 2 mL).
Les tubes sont ensuite incubés 18 heures à 37 °C.

Compléter le plan d’étude avec cette nouvelle information.

Pour chaque tube de la gamme déterminer la concentration :
-en pénicilline avant ajout de l'inoculum ;
-en pénicilline après ajout de l'inoculum ;

Indiquer le rôle du tube 1 de la gamme

Exemple de résultat obtenu pour la détermination de la CMI en milieu liquide

- de gauche à droite dans les 10 premiers tubes : dilutions en série de raison 2 de l'antibiotique testé.
- le tube 11 à droite ne contient pas de solution d'antibiotique mais uniquement le diluant (bouillon Mueller-Hinton) et l'inoculum bactérien)

Exemple de tableau de réalisation en microméthode 

Vérification de la pureté de la suspension fournie : présenter l’étude macroscopique de l'isolement réalisé sur GNO.

Conclure :
-quant à la pureté de la suspension fournie en J1 ;
-quant à la validité de la détermination de la CMI.

Détermination de la CMI :

Présenter sous forme d’un tableau :

• Le numéro du tube ;
• La concentration en pénicilline avant ajout de l'inoculum en µg · mL^-1 ;
• La concentration  en pénicilline après ajout de l'inoculum en µg · mL^-1 ;
• La présence ou l’absence de culture.

Vérifier la cohérence des résultats.

Déterminer la CMI de la pénicilline vis à vis de la souche étudiée. Justifier la réponse.

Indiquer si cet antibiotique peut être utilisé chez le patient.

Données pour la pénicilline :
-Concentration critique inférieure (CCI) :                           0,25 µg · mL^-1
-Concentration critique supérieure (CCS) :                          16    µg · mL^-1

Par ailleurs, l'efficacité d'un antibiotique peut être testée en cours de croissance bactérienne : ici, ajout de 1 mL d'une solution réhydratée d'amoxicilline à 250 mg · 5 mL^-1 en cours de croissance d'Escherichia coli, lors de la phase exponentielle de croissance :

Un cas d'étude clinique complet avec antibiogramme en milieu gélosé, détermination de la CMI en milieu liquide, identification avec milieu chromogène et par galerie API.