Analyse étiologique d'une toxi-infection aimentaire collective (TIAC)

Objectif : déterminer l’origine (étiologie) d’une toxi-infection alimentaire collective (TIAC) par deux approches différentes :

  • Une identification microbiologique du micro-organisme responsable, par des techniques de microbiologie conventionnelles 
  • Une identification de la toxine par méthode immunologique

 

L'acronyme T.I.A.C. (Toxi-infections Alimentaires Collectives) recouvre différents mécanismes de pouvoir pathogène. On distingue ainsi :

  • les intoxinations vraies (ou intoxications) où tous les troubles sont dus exclusivement à l'ingestion d'une toxine bactérienne préformée dans l'aliment (ex. bactéries Clostridium botulinium, Staphylococcus aureus entérotoxique)
  • Les infections « d'origine alimentaire » = toxi-infections : il faut qu'il y ait ingestion d'aliment contenant des bactéries vivantes et qu'on les retrouve dans les muqueuses intestinales où elles se développent (bactéries entéro-invasives qui colonisent la muqueuse et peuvent envahir l'organisme = septicémie).

Certaines souches d’Escherichia coli sont productrices de shigatoxines responsables de colites hémorragiques. La transmission se fait via la consommation d'eau ou d'aliments contaminés par des matières fécales ou par contact de personne infectée à personne saine. Plusieurs souches et sérotypes plus ou moins virulents ont été isolés dans le monde. Le sérotype correspond à la classification des micro-organismes en fonction de la présence d’antigènes de surface.
E.coli O157:H7 est un sérotype d’E .coli potentiellement mortel, qui a pour principal habitat l'intérieur des intestins des bovins, a par exemple provoqué le décès de 35 personnes en Allemagne en 2011. La lettre « O » désigne un antigène de paroi et la lettre « H » désigne un antigène de flagelle.
Exemple 2024https://www.bfmtv.com/societe/une-fillette-de-7-ans-hospitalisee-depuis-decembre-apres-avoir-mange-du-fromage-contamine-par-e-coli_AV-202402090107.html

Staphylococcus aureus est le seul staphylocoque à produire éventuellement une entérotoxine (toxine protéique agissant au niveau intestinal) thermostable (résiste à 100 °C pendant une heure) et résistante aux sucs digestifs. Si cette toxine est produite dans l'aliment (la contamination se fait généralement en cuisine lors de la préparation), et même si celui-ci est chauffé, son ingestion provoquera, moins de 6 heures après son ingestion, des vomissements, nausées, douleurs abdominales qui disparaissent spontanément, généralement sans laisser de séquelles. Toutefois, chez de très rares individus, la toxine staphylococcique provoque la mort (sensibilités individuelles ou conditions physiologiques particulières).
30 à 60 % des souches de S. aureus produisent une entérotoxine pendant la phase exponentielle de croissance.
 

La souche à étudier provenant d'un malade, un micro-organisme de classe 2 (1), a été inoculée dans un bouillon cœur-cervelle et sur gélose nutritive ordinaire en tube, puis incubée 24 heures à 37 °C
(1) : agents biologiques pouvant provoquer une maladie chez l'homme ; leur propagation dans la collectivité est peu probable ; il existe généralement une prophylaxie ou un traitement efficaces 

 

CARACTERISTIQUES DE DEUX BACTERIES RESPONSABLES DE TIAC

  • Relever dans le contexte la·les différence·s entre intoxination et toxi-infection alimentaire.
  • Indiquer quel type d’intoxications alimentaires provoquent Staphylococcus aureus et Escherichia coli O157:H7.
  • Rechercher la signification des termes « sérotype » et « O157:H7 ».

 

IDENTIFICATION ET DENOMBREMENT DU MICRO-ORGANISME RESPONSABLE DE LA TIAC

Le document 1 (Source : livre Biotechnologies - Delagrave) présente les grandes étapes de la recherche d’un micro-organisme particulier dans un prélèvement polymicrobien.

Les documents 2 et 3 présentent respectivement les milieux Baird-Parker et EMB, deux milieux sélectifs et différentiels couramment utilisés dans ce type d’analyse.

Le document 4 présente la procédure opératoire à mettre en oeuvre pour le dénombrement dans la masse d'un miieu gélosé.

Le document 5 présente la nrme ISO 7218.

Etapes tiac

 

 

Baird parker

Emb et dilution

Iso 7128

  • Expliquer les termes « milieu sélectif » et « milieu différentiel d'orientation ».
  • Indiquer pour quels types de bactéries est utilisé : le milieu Baird Parker ; le milieu EMB.
  • Calculer la dilution de l’aliment.
  • Rédiger un schéma légendé illustrant la réalisation des dilutions et du dénombrement (procédure M2 jour 1) en indiquant les instruments et volumes nécessaires.
  • Identifier une erreur possible liée à la réalisation des dilutions décimales.

 

Orientation : critères microscopiques & étude du métabolisme respiratoire et glucidique

  • Réaliser une coloration de Gram. Observer (micromètres-oculaires à disposition - Étalonnage : 1 graduation à l'objectif x100 ≡ 1 µm).
  • Réaliser le test d'orientation rapide adapté.
  • Ensemencer un milieu Viande-Foie et un milieu Hugh & Leifson.
  • Réaliser un isolelement sur les géloses fournies

 

Exemples de résultats obtenus.

a) Frottis fixé coloré au Gram
Remarque : le frottis peut être préparé :
- soit à partir du bouillon coeur-cervelle
- soit à partir du liquide de condensation présent au bas de la gélose inclinée
- soit en déposant un peu de culture solide dans une goutte d'eau distillée déposée sur une lame

Culture sur gni

Gram staphylococcus aureus

  • Rédiger un compte-rendu de l'observation microscopique

 

b) Test enzymatique d'orientation
Remarque : ce test doit impérativement êtreréalisé avec un instrument non métallique (à justifier d'après la fiche technique) ET à partir de colonies provenant d'un milieu solide.

Test orientation

  • Justifier le choix de ce test, puis rédiger observation, interprétation, conclusion.
  • Résumer les caractères et réaliser une pré-orientation du micro-organisme.
  • Indiquer l'intérêt du bouillon de Chapman.

c) Etude du métabolisme respiratoire (millieu Viande-Foie)
Type respiratoire

d) Etude du métabolisme glucidique (miieu Hugh & Leifson)
Voie attaque glucose

  • Étude du métabolisme bactérien : présenter, sous forme de tableau synthétique : observation, interprétation, conclusion pour les milieux Viande-Foie et Hugh & Leifson
  • Confirmer l'orientation faite en jour 1 à l'aide des résultats de l'étude du métabolisme.

e) Identification de la souche

Etude macroscopique de l'isolement réalisé sur milieu CHAPMAN

Staph aureus 2

Etude macrospique de l'isolement réalisée sur milieu BAIRD-PARKER

Baird parker staph aureus 3 1

  • Étude des milieux d'isolements Chapman et Baird-Parker : présenter, sous forme de tableau synthétique : observation, interprétation, conclusion.
  • Indiquer la conclusion pouvant être apportée par la lecture de chaque milieu.

f) Identification de la souche par test d'agglutination sur lame (Pastorex Staph Plus)

Pastorex staph plus

  • Présenter le principe de ce test.
  • Indiquer ce que le test Pastorex Staph Plus permet de rechercher.
  • Schématiser, au niveau moléculaire et à l'aide de la légende du document 3, l'édifice moléculaire aboutissant à la formation d'un agglutinat visible à l'œil nu (cas d'un test positif).
  • Schématiser le résultat de chacun des deux tests (témoin et essai).
  • Interpréter et conclure

Pastorex staph plus

 

Comparaison de deux tests d'agglutination de fabricants différents

 Img 20190321 183924 588

  • Résumer tous les caractères morphologiques, culturaux et biochimiques de la souche étudiée et confirmer (ou infirmer) son appartenance à l'espèce aureus

 

g) Recherche de la thermonucléase pour détermination du caractère entérotoxique de la souche préalablement identifiée

Thermoclease adnase e

  • Indiquer quel est le lien entre entérotoxine staphylococcique et thermonucléase.
  • Recherche de l'entérotoxine : schématiser, en utilisant les légendes proposées dans le document 1, l'assemblage moléculaire à la fin de la dernière étape de la recherche de l'entérotoxine par la technique immuno-enzymatique dans le cas d'un témoin positif
  • Recherche de la thermonucléase
    -Schématiser l'aspect de chaque test effectué, interpréter et conclure.
    -Proposer la réalisation de témoins (positif et négatif) qui auraient dû être réalisés.
  • Conclure sur le caractère entérotoxique de la souche testée.

 

Détermination du profil de sensibilité de la souche étudiée vis à vis de différents antibiotiques par la technique de l'antibiogramme standard

Staph aureus 3

Staph aureus 4

Abaques antibio

  • Rédiger un schéma légendé de la gélose après l'incubation incluant : disque d'antibiotique, zone d'inhibition de culture, culture, zone correspondant à la concentration minimale inhibitrice.
  • Reproduire et compléter le tableau suivant 
  • Indiquer quel(s) antibiotique(s) choisir pour traiter le patient.

Antibiogramme tableau

 

Détermination du la concentration minimale inhibitrice de la ceftriaxone sur S. aureus par dilution en milieu liquide

Préparation de l’inoculum bactérien  :
À partir d'une culture pure de 18 h (isolement sur GNO) :

-Préparer une suspension en eau physiologique équivalente à un étalon 0.5 Mc Farland
-
Introduire 200 µL de cette suspension dans 25 mL de bouillon Mueller-Hinton
-
Distribuer 1 mL dans 16 tubes à hémolyse è tubes notés INO.

Réalisation des dilutions en série de la solution d'antibiotique (1 plaque par binôme)
-Déposer 100 µL de milieu Mueller-Hinton  dans les puits 1 à 12.
-Déposer 100 µL d'antibiotique Ceftriaxone à 2,5  mg.mL-1 dans le puits 1
-Après aspiration-refoulement, prélever 100 µL du puits 1 et les introduire dans le puits 2.
-Répé"ter l'opération jusqu'au puits 11.
-Prélevler 100 µL du puits 11, les jeter dans l'eau de Javel
-Déposer 100 µL d'inoculum bactérien dans les puits 1 à 12.
-Incubaer 18 h à 37 °C après avoir fermé hermétiquement les puits.

Vue d'ensemble :

Img 20170210 151002

Vue détaillée des puits 8 à 12 après 18 h d'incubation à 37 °C :

Img 20170210 153851

Cmi ceftriaxone

Détermination de la CMI en milieu liquide : pour l’antibiotique testé, résumer sous forme de tableau les informations suivantes :

- Les volumes de milieu Mueller-Hinton dans chaque cupule
- Le volume de solution d'antibiotique introduit dans la cupule 1.
- Le volume transféré entre chaque cupule
- La concentration intermédiaire en antibiotique exprimée en µg.mL-1 dans chaque tube
- Le volume d'inoculum bactérien introduit dans chaque cupule
- La concentration finale en antibiotique exprimée en µg.mL-1 dans chaque tube
- La présence (+) ou l’absence (-) de culture dans chaque cupule

  • En déduire la CMI de la ceftriaxone sur la souche testée.
  • Indiquer si la bactérie étudiée est sensible, intermédiaire ou résistante à cet antibiotique en utilisant les donnes fournies.

Présentation de l’antibiotique Ceftrixaone

La ceftriaxone est un antibiotique de la famille des bêtalactamines du groupe des céphalosporines de 3ème génération : c’est une céphalosporine semi-synthétique à très large spectre d'action et résistante aux bêtalactamases.

Date de dernière mise à jour : 05/03/2024

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