Objectifs :

• Rechercher sur un site de bio-informatique les caractéristiques d'un plasmide et prévoir la taille du/des fragments attendus suite à une restriction enzymatique virtuelle par l'enzyme AvaI (Eco88I) ;
• Extraire un ADN plasmidique à partir d'un petit volume de culture bactérienne afin d'obtenir une solution pure et concentrée du plasmide extrait d'une souche d'E. coli (miniprep)
• Estimer la concentration rHO_{( plasmidique  ; extrait)} de la solution d’ADN plasmidique et sa pureté
• Linéariser le plasmide extrait par une enzyme de restriction pour évaluer sa taille sur gel d’agarose
• Vérifier, par électrophorèse sur gel d’agarose (vidéo qui présente la technique avec un produit dangereux, le bromure d'éthidium, et une manipulation de du transiluminateur UV qui est riticable) si le plasmide a bien été extrait et linéarisé par comparaison avec la prévision théorique.

L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire : séquençage, PCR, clonage... Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe :

Restriction in silico

Le site NEBcutter v2.0 permet de simuler rapidement et simplement (entre autres possibilités) une restriction enzymatique d'une molécule d'ADN, qu'elle soit plasmidique, virale ou phagique (il est également possible d'importer sa propre séquence ou une séquence provenant d'une banque de donnée).

 

Un exemple d'utilisation est décrit dans l'activité "Restriction d'ADN phagique".

Extraction rapide et purification du plasmide pUC18 (miniprep)

pUC18 est un petit plasmide à fort taux de réplication assurant ainsi de bon rendement d’extraction.

L'extraction purification se fait par une méthode décrite en 1974 :

1^ère étape : lyse des cellules

La lyse cellulaire consiste à utiliser des réactifs et des conditions permettant de déstructurer les enveloppes des différents compartiments emprisonnant l’ADN. Les cibles des différents réactifs sont donc les molécules constitutives des enveloppes cellulaires (protéines des membranes cellulaires, peptidoglycane des parois bactériennes …)

Tableau 1 : principaux réactifs pour lyser les cellules au cours d’une extraction d’ADN

Photos illustrant les étapes d'extraction / purification :

Analyse qualitative et quantitative de la solution d'ADN plasmidique extrait par spectrophotométrie

Exemple de valeurs relevées (Moyens : semi-microcuves "UVettes", spectrophotomètre VWR UVA600PC) : 

Données : 

Linéarisation du plasmide pUC18 extrait par restriction enzymatique par l'enzyme AvaI

Extrait de la notice de l'enzyme utilisée :

Vérification par électrophorèse sur gel d'agarose de l'extraction/purification/linéarisation

Les illustrations de la préparation du gelo d'agarose, de la réalisation des dépôts, de l'électrophorèse et des marqueurs de taille moléculaires sont déjà répertoriées dans l'activité "Restriction d'ADN phagique".

Résultat de l'électrophorèse (gel d'agarose à 0,8 % (m/V), migration en tampon Tris-Borate-EDTA 1x pH 8,6 75 minutes à 80 V).

• Puits 1 à 4 : extraction/purification/linéarisation par 4 binômes différents
• Puits 5 : marqueur de taille GenrRuler 1 kb DNA ladder
• Puits 6 à 9 : extraction/purification/linéarisation par 4 binômes différents
• Puits 10 : extraction/purtification sans linéarisation, sans ajout d'ARNase et avec un protocole d'extraction légèrement différent.

Extraction rapide d'ADN plasmidique bactérien (miniprep) par lyse alcaline

 Calculer V_plasmide à prélever pour préparer la solution diluée (équations aux grandeurs, aux unités et aux valeurs numériques exigées)

Reproduire et compléter le tableau suivant :

Analyse qualitative : évaluer la pureté de l’ADN plasmidique extrait vis à vis :
- des protéines d’une part ;
- des solvants organiques d’autre part.

Analyse quantitative :
- Calculer la concentration en masse rho_{( plasmidique  ; extrait)} de la miniprep obtenue
- En déduire la masse totale d’ADN plasmidique extrait.

Digestion enzymatique de pUC18 par EcoRI

Justifier tous les calculs de volumes introduits dans le tube pour réaliser la digestion.

Indiquer le rôle de l'étape de 5 min au bain thermostaté à 65 °C.

Utiliser le site Nebcutter v.20 pour : 

• Vérifier la taille du plasmide pUC18 par rapport à celle mentionnée dans le document 1.
• Vérifier la présence du gène codant l'enzyme de résistance à antibiotique.
• Vérifier la localisation du site de restriction (= séquence de l'ADN reconnue par l'enzyme Eco88I) sur le plasmide.
• Relever la séquence du site de restriction de cette enzyme (Adenine and guanine belong to the class of molecules called purines, abbreviated as R ; Cytosine, thymine, and uracil are pyrimidines, abbreviated as Y).
• Réaliser une digestion enzymatique virtuelle (restriction in silico)
• Visualiser la migration du fragment linéaire obtenu en comparaison avec un marqueur de taille moléculaire.

Digestion enzymatique de pUC18 par Eco88I

Annoter l’électrophorégramme : titre, sens de migration de l'ADN, légende du contenu des puits, conditions de migration (% d'agarose, durée de migration, voltage, agent révélateur et procédure de révélation, position et taille des marqueurs de taille moléculaire.

Estimer la taille de l'ADN plasmidique extrait non digéré et digéré.

Estimer la quantité du produit d'ADN plasmidique digéré déposé sur le gel en ng

Aller plus loin : approfondissement des techniques de séparation ; l'électrophorèse en champ pulsé.
Un élève ayant proposé une amélioration pertinente de l'électrophorèse en ajoutant un second champ électrique, il fut assez vite compris qu'il était pertinent de faire osciller chaque champ selon un intervalle de temps régulier (sait-on jamais, si cela venait à tomber au bac ^^).

Tutoriel détermination taille acide nucléique après électrophorèse