Extraction, restriction et sépération électrophorétique d'un plasmide
Objectifs :
Rechercher sur un site de bio-informatique les caractéristiques d'un plasmide et prévoir la taille du/des fragments attendus suite à une restriction enzymatique virtuelle par l'enzyme AvaI (Eco88I) ;
Extraire un ADN plasmidique à partir d'un petit volume de culture bactérienne afin d'obtenir une solution pure et concentrée du plasmide extrait d'une souche d'E. coli (miniprep)
Estimer la concentration rHO( plasmidique ; extrait)de la solution d’ADN plasmidique et sa pureté
Linéariser le plasmide extrait par une enzyme de restriction pour évaluer sa taille sur gel d’agarose
Vérifier, par électrophorèse sur gel d’agarose(vidéo qui présente la technique avec un produit dangereux, le bromure d'éthidium, et une manipulation de du transiluminateur UV qui est riticable) si le plasmide a bien été extrait et linéarisé par comparaison avec la prévision théorique.
L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire : séquençage, PCR, clonage... Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe :
Restriction in silico
Le site NEBcutter v2.0 permet de simuler rapidement et simplement (entre autres possibilités) une restriction enzymatique d'une molécule d'ADN, qu'elle soit plasmidique, virale ou phagique (il est également possible d'importer sa propre séquence ou une séquence provenant d'une banque de donnée).
Extraction rapide et purification du plasmide pUC18 (miniprep)
pUC18 est un petit plasmide à fort taux de réplication assurant ainsi de bon rendement d’extraction.
L'extraction purification se fait par une méthode décrite en 1974 :
1ère étape : lyse des cellules
La lyse cellulaire consiste à utiliser des réactifs et des conditions permettant de déstructurer les enveloppes des différents compartiments emprisonnant l’ADN. Les cibles des différents réactifs sont donc les molécules constitutives des enveloppes cellulaires (protéines des membranes cellulaires, peptidoglycane des parois bactériennes …)
Tableau 1 : principaux réactifs pour lyser les cellules au cours d’une extraction d’ADN
Réactifs
Rôles
Exemples
DETERGENTS
Molécules amphiphiles[1]qui en s’intégrant aux membranes cellulaires, les désorganisent et qui dénaturent les protéines membranaires
SDS (Dodécylsulfate de sodium), triton , Tween, CTAB (Bromure de cétrimonium) …
DENATURANTS
protéique
Molécules rompant les interactions faibles des molécules protéiques en déstabilisant leur structure tridimensionnelle (IIaire, IIIaire, IVaire)
SDS, urée, sels de guanidium, NaOH …
Agents réducteurs des ponts disulfures
Molécules qui, en réduisant les ponts disulfures (S-S) par rupture de la liaison covalente entre deux fonctions cystéine SH, facilitent la dénaturation des protéines.
DTT (Dithiothréitol),
Mercapto-éthanol …
ENZYMES hydrolytiques
(ou hydrolases)
Protéines catalysant la réaction d’hydrolyse d’une molécule cible des enveloppes cellulaires ou du cytosol
Protéinase K è Protéines
Lysosymeè Peptidoglycane
Cellulase è Cellulose
RNASE è ARN
2ème étape : séparation de l'ADN des autres constituants cellulaires
Différentes variantes sont employées pour obtenir l'ADN désiré, suivant que l'on cherche à extraire de l'ADN génomique (issu du ou des chromosomes des cellules analysées) ou de l'ADN plasmidique (provenant de plasmides portés le plus souvent par des bactéries comme Escherichia coli). Les étapes principales restent toutefois similaires :
Élimination des protéines
Élimination des autres acides nucléiques (ARN, etc.)
Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool
L’ADN plasmidique peut être extrait sans utiliser de kits onéreux. La préparation d'ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes est l'une des techniques les plus courantes de la biologie moléculaire, également connue sous les noms abrégés de miniprep, midiprep et maxiprep en fonction du volume de la culture bactérienne utilisée (une minipréparation ou miniprep permet d'extraire une petite quantité [100 ng à 5 μg] d'ADN sous forme de plasmide).
Photos illustrant les étapes d'extraction / purification :
Analyse qualitative et quantitative de la solution d'ADN plasmidique extrait par spectrophotométrie
Exemple de valeurs relevées (Moyens : semi-microcuves "UVettes", spectrophotomètre VWR UVA600PC) :
Longueurs d’onde
Absorbances mesurées
230 nm
0,814
260 nm
0,724
280 nm
0,387
Données :
Acide nucléique
Coefficient d'absorption linéique molaire en μg · mL-1 · cm-1
Concentration en masse correspondant à une unité d’absorbance
ADN bicaténaire
0.020
rho(ADNdb ; solution) = 50 µg · mL-1
ARN monocaténaire
0.025
rho(ARNsb ; solution) = 40 µg · mL-1
Linéarisation du plasmide pUC18 extrait par restriction enzymatique par l'enzyme AvaI
Extrait de la notice de l'enzyme utilisée :
Vérification par électrophorèse sur gel d'agarose de l'extraction/purification/linéarisation
Les illustrations de la préparation du gelo d'agarose, de la réalisation des dépôts, de l'électrophorèse et des marqueurs de taille moléculaires sont déjà répertoriées dans l'activité "Restriction d'ADN phagique".
Résultat de l'électrophorèse (gel d'agarose à 0,8 % (m/V), migration en tampon Tris-Borate-EDTA 1x pH 8,6 75 minutes à 80 V).
Puits 1 à 4 : extraction/purification/linéarisation par 4 binômes différents
Puits 5 : marqueur de taille GenrRuler 1 kb DNA ladder
Puits 6 à 9 : extraction/purification/linéarisation par 4 binômes différents
Puits 10 : extraction/purtification sans linéarisation, sans ajout d'ARNase et avec un protocole d'extraction légèrement différent.
Extraction rapide d'ADN plasmidique bactérien (miniprep) par lyse alcaline
Calculer Vplasmide à prélever pour préparer la solution diluée (équations aux grandeurs, aux unités et aux valeurs numériques exigées)
VTD de tampon de restriction FastDigest Greenbuffer 10X
VFD = µL
VpUC18 d’ADN plasmidique pUC18 (correspondant à 1 µg)
VpUC18 = µL
VEco88I d’enzyme Eco88I à 10 U · µL-1 (correspondant à 10 U · µg-1 d’ADN)
VEcoRI = µL
Veau BM µL d’eau qualité BM qsp 20 µL
Veau = µL
Indiquer la composition exacte (qualitative et quantitative) du blanc réactif à préparer pour mesurer les absorbances de la solution d'ADN plasmidique dilué au 1/50.
Reproduire et compléter le tableau suivant :
Longueurs d’onde
Absorbance mesurée
Rapport
230 nm
260 nm
280 nm
260 nm / 280 nm
260nm /230 nm
Analyse qualitative : évaluer la pureté de l’ADN plasmidique extrait vis à vis : - des protéines d’une part ; - des solvants organiques d’autre part.
Analyse quantitative : - Calculer la concentration en masse rho( plasmidique ; extrait) de la miniprep obtenue - En déduire la masse totale d’ADN plasmidique extrait.
Digestion enzymatique de pUC18 par EcoRI
Justifier tous les calculs de volumes introduits dans le tube pour réaliser la digestion.
Indiquer le rôle de l'étape de 5 min au bain thermostaté à 65 °C.
Vérifier la taille du plasmide pUC18 par rapport à celle mentionnée dans le document 1.
Vérifier la présence du gène codant l'enzyme de résistance à antibiotique.
Vérifier la localisation du site de restriction (= séquence de l'ADN reconnue par l'enzyme Eco88I) sur le plasmide.
Relever la séquence du site de restriction de cette enzyme (Adenine and guanine belong to the class of molecules called purines, abbreviated as R ; Cytosine, thymine, and uracil are pyrimidines, abbreviated as Y).
Réaliser une digestion enzymatique virtuelle (restriction in silico)
Visualiser la migration du fragment linéaire obtenu en comparaison avec un marqueur de taille moléculaire.
Digestion enzymatique de pUC18 par Eco88I
Annoter l’électrophorégramme : titre, sens de migration de l'ADN, légende du contenu des puits, conditions de migration (% d'agarose, durée de migration, voltage, agent révélateur et procédure de révélation, position et taille des marqueurs de taille moléculaire.
Estimer la taille de l'ADN plasmidique extrait non digéré et digéré.
Estimer la quantité du produit d'ADN plasmidique digéré déposé sur le gel en ng.
Aller plus loin : approfondissement des techniques de séparation ; l'électrophorèse en champ pulsé. Un élève ayant proposé une amélioration pertinente de l'électrophorèse en ajoutant un second champ électrique, il fut assez vite compris qu'il était pertinent de faire osciller chaque champ selon un intervalle de temps régulier (sait-on jamais, si cela venait à tomber au bac ^^).
Tutoriel détermination taille acide nucléique après électrophorèse
Date de dernière mise à jour : 02/06/2024
Commentaires
1
Imane Akdim
Le 13/02/2023
Hi, why their is a large dark spot down in the gel?
Sébastien DroguetLe 14/02/2023
The loasding solution contains two colored markers to follow the migration.
The student responsible for well 10 likely introduced a much larger volume of loading solution than was intended.