Restriction enzymatique d'un plasmide vecteur de clonage
Objectif : étudier des outils de biologie moléculaire (plasmides, enzymes de restriction) utilisés couramment en génie génétique pour la création de vecteurs de clonages.
Lors d’un stage au laboratoire du lycée, un élève de terminale a été chargé de réceptionner et d’aliquoter des réactifs de biologie moléculaire dont deux plasmides nommés pBR322 et pUC18. Toutefois, il a oublié d’étiqueter les microtubes après avoir aliquoté chaque solution plasmidique. Son tuteur lui suggère de réaliser une double restriction enzymatique sur un des deux plasmides afin de l’identifier par les fragments de restriction révélés après électrophorèse sur gel d’agarose.
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Initiation à la bio-informatique - Restriction in silico
La consultation de l’inventaire du laboratoire indique la présence de deux enzymes de restrictions nommées AvaI et HindIII. Le tuteur indique un site internet permettant de simuler numériquement une restriction enzymatique (= restriction in silico) : NEBcutter v3.0 : https://nc3.neb.com/NEBcutter/
Afin de préparer sa manipulation en la simulant numériquement (= bio-informatique), l’élève va réaliser successivement les opérations suivantes pour chacun des deux plasmides :
-Dans « 1. Input sequence », chercher le premier plasmide dans la liste déroulante des vecteurs plasmidiques. Cocher « Circular ».
-Cliquer sur « submit » pour accéder à la carte graphique.
-Relever la taille du plasmide (exprimée en paire de bases) et le GC %.
-Rechercher le rôle des éléments notées a et/ou b présents sur les plasmides.
-En déduire le·s propriété·s apportéé·s par chacun de ces plasmides à un bactérie le possédant.
Sur la page affichant la carte du plasmide (cf. Q3), cliquer sur « custom digest ».
-Rechercher les deux enzymes de restriction disponibles au laboratoire.
-Relever combien de fois chaque enzyme coupe le plasmide (« cuts »).
-En déduire le nombre de fragments de restriction obtenus : a) pour chaque enzyme utilisée seule ; b) pour les deux enzymes utilisées simultanément.
-Recopier la séquence (simple brin) de restriction (notée « specificity ») avec les triangles noirs.
-Ecrire la séquence du brin d’ADN complémentaire.
Données : « Y » désigne un nucléotide composé d’une base pyrimidique (T ou C ) et « R » désigne un nucléotide composé d’une base purique (A ou G) : « Y » et « R » sont donc complémentaires.
-En déduire comment chaque enzyme va couper la séquence de restriction (= séquence cible).
Exemple :
Représenter le résultat de la digestion enzymatique de la séquence cible de chaque enzyme.
indiquer la nature de ces extrémités : 5' sortantes, 3' sortantes ou franches.
Choisir le tampon le plus adapté : -pour une restriction utilisant chaque enzyme seule ;
-pour une double restriction.
Argumenter ce choix.
Réaliser la double restriction in silico pour chacun des deux plasmides sur le site NEBcutter suivie de la simulation de la séparation électrophorétique :
-Cocher les deux enzymes à utiliser.
-cliquer sur « digest » (rectangle vert en bas).
-Repérer les deux sites de restriction (estimation visuelle de la taille des fragments de restriction)
-Cliquer sur « view gel ».
-Dans la nouvelle fenêtre simulation le gel d’agarose, choisir le pourcentage d’agarose correspondant à celui utilisé dans la manipulation (document 3).
-Choisir le marqueur de taille correspondant à celui utilisé dans la manipulation (document 3).
-Relever la taille de chacun de fragments de restriction (tableau) et la position sur le gel (une copie écran est recommandée). Survoler avec le curseur l’échelle de marqueur de taille moléculaire et les fragments pour voir apparaître leurs tailles.
Préparation de la restriction
En utilisant le document 2, choisir le tampon le plus adapté pour réaliser une double restriction
(= digestion simultanée) avec AvaI et HindIII. Argumenter ce choix.
Le tableau de manipulation est indiqué dans le document 3.
Expliquer pourquoi :
-le diluant porte la mention « eau qualité biologie moléculaire ».
-le diluant doit toujours être introduit en premier dans le mélange réactionnel.
Expliquer la signification de la mention « 10X » du tampon adapté à la restriction.
En déduire la dilution à effectuer pour obtenir la concentration voulue dans le volume final.
Valider que le volume proposé de chaque enzyme, de concentration d’activité catalytique notée b(enzyme ; soution d’enzyme) = 10 U · µL-1 permet bien :
- d’apporter entre 5 et 20 U pour 1 000 ng d’ADN
- avec un volume d’enzyme au maximum égal à 1/10 du volume total.
Données : « U » désigne la grandeur « unité enzymatique » qui correspond à une activité enzymatique.
(Aucune connaissance détaillée en enzymologie n’est nécessaire pour cette argumentation)
Reproduire et compléter le tableau de manipulation. Pour ce faire :
-relever le volume final attendu dans le tube ;
-calculer le volume de solution d’ADN plasmidique à ajouter ;
-calculer le volume de tampon à ajouter ;
-calculer le volume de diluant eau qualité BM à ajouter.
Indiquer la composition détaillée d’un tube ne contenant pas les enzymes de restriction.
Proposer un rôle pour ce tube et prévoir le résultat attendu.
Résumer en cinquante mots maximum le principe de l’électrophorèse en gel d’agarose.
Légender l’électrophorégramme : titre, bornes et sens de migration, composition du mélange réactionnel, des solutions déposées dans les puits, les conditions de migration, comme indiqué dans le document suivant.
Estimer la taille des fragments obtenus à l’aide de l’échelle fournie par les marqueurs de taille moléculaire.
Identifier le plasmide à l’aide des fragments obtenus.
Expliquer la présence de trois bandes dans la piste suivante
Date de dernière mise à jour : 02/06/2024
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