Électrophorèse de protéines sur gel d'agarose

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

Séparation et identification de protéines par électrophorèse sur gel d’agarose

  • préparation d'un gel d'agarose à 1 % (m/V) ;
  • préparation des solutions de dépôt : solutions étalon d'ovalbumine, de caséine, de lysozyme et de différents milieux biologiques complété avec du tampon de charge (bleu de bromophénol pour suivre la migration et saccharose ou glycérol comme alourdisseur) : voir photo
  • électrophorèse à voltage constant pendant 1h en tampon TBE (Tris Borate EDTA) pH 8,6 : voir photo
  • révélation des protéines:
    • au rouge Ponceau ;
    • au bleu de Coomassie, qui se fixe, par des liaisons faibles, aux acides aromatiques (phénylalanine, tyrosine, tryoptophane)

Comparaison de deux méthodes de révélation des protéines : au rouge Ponceau et au bleu de Coomassie : quelle conclusion tirer ?

Ponceau vs coomassie

  • Le rouge Ponceau est peu sensible, il se décolore avec le temps, n'est pas facile à photographier (le contraste entre les bandes colorées et le reste du gel est difficile à photogaphier, sauf si l'on dispose d'un Imager) iues de captage d'image (caméras ou "scanner"). 
  • le bleu de Coomassie est plus sensible,  la coloration est irréversible. 

 

Electrophorégramme après révélation au bleu de Coomassie

Remarque : la qualité réelle est supérieure au rendu photo ; une image de qualité nécessite un "imager", scanner spécialisé dans la numérisation des gels d'électrophorèse, comme ce modèle qui équipera prochainement notre laboratoire.

Electrophorese revelation paillot m 5

 

Edit mai 2016 : le scanner de gel étant arrivé, le gel, conservé depuis le mois d'octobre (soit 8 mois) à 4 °C, emballé dans du film cellophane et imprégné de tampon TBE 1X, a été scanné :

Electrophorese proteines agarose 2 1

Légendes des dépôts :

  1. solution étalon d'ovalbumine
  2. solution étalon de lysozyme
  3. solution étalon de caséine
  4. blanc d'oeuf
  5. salive
  6. cachet de Maxilase préalablement dissout
  7. lait UHT écrémé
  8. blanc d'oeuf dilué au 1/10
  9. solution étalon d'ovalbumine
  10. solution étalon de lysozyme

 

Quelles conclusions tirer :

  • concernant la composition qualitative des milieux biologiques testés (salive, blanc d'oeuf, lait UHT) ?
  • concernant la charge globale, et donc le pHi (pH pour lequel une molécule est sous forme d'ion mixte ou swittertion) comparé au pH du tampon), de chaque protéine étalon ?

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Date de dernière mise à jour : 06/09/2017