Objectif : extraire et purifier partiellement un pigment bactérien fluorescent pouvant être utilisé comme bio-encre

Présentation sommaire des grandes étapes de l'extraction et caractrisation d'un pigment bactérien fluorescent dans le but d'obtenir une bioencre

Recherches effectuées : bioluminescence, biofluorescence, micro-organismes fluiorescents, pigments fluorescents, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, pycyanine, pyoverdine, milieu de culture, technique de séparation, propriétés antibactériennes ...

Procéudres opératoires mises en oeuvre :

Recherche et préparation d'un milieu de culture adapté à a production du pigment (pyoverdine) par la bactérie retenue (P. fluorescens)

Milieux destinés à favoriser la production de pigments diffusibles dans le milieu :
-King A : permet la mise en évidence de la pyocyanine (pigment diffusible de couleur bleue, soluble dans l’eau et le chloroforme). Seul Pseudomonas aeruginosa synthétise ce pigment. Ce milieu favorise la production de pyocyanine et diminue la production de fluorescéine.
King B : permet la mise en évidence de la pyoverdine (pigment diffusible de couleur jaune-vert fluorescent, soluble dans l’eau et insoluble dans le chloroforme. La synthèse est favorisée par une carence en fer et par une présence en sulfate de magnésium.

Composition en g·L^-1

King A
Peptone de gélatine.............................................. 20
Glycérol............................................................... 10
Chlorure de magnésium......................................... 1,4
Sulfate de potassium............................................ 10
Agar.................................................................... 12
pH final................................................................. 7,2

 King B
Peptone de gélatine.............................................. 20
Glycérol................................................................ 10
Sulfate de magnésium hepta hydraté...................... 1,5
Hydrogénophosphate de potassium......................... 1,5
Agar...................................................................... 12
pH final................................................................. 7,2

Vérification de la production de pigment pyoverdine sous UV à deux longueurs d'onde différentes

Déterminer la longueur d'onde dans le dimaine UV la plus adaotée à la mise en évidence du pigment.

Remarque : cette observation renvoie à l'analyse spectrophotométrique du matériau des cuves disponibles dans notre laboratoire :

Propriétés de l'ADN

Récupération du pigment pyoverdine (pigment extracellulaire diffusible)

La pyoverdine est un sidérophore extracellulaire, aussi l’extraction est relativement simple et a été mise en œuvre de ces deux façons :

À partir du bouillon King B	À partir de la gélose
-Centrifugation à 13 000 g -Récupération du sunrgeant contenant la pyoverdine	-Lyse mécanique de la gélose avec mortier, pilon, sable de Fontainebleau -Filtration sur papier filtre -Centrifugation à 13 000 g

Remarques :
-un chauffage a été envisagé  afin de ramener la gélose en surfusion mais éliminé en raison du risque de destruction thermique du pigment
-une étape de microfiltration sur membrane de porosité 0,45 µm aurait pu compléter l’extraction afin de garantir une absence totale de bactérie dans la solution de pigment.

Conversion du nombre de tours par minute en accélération centrifuge radiale (ACR) exprimée en g (= accélération de la pesanteur, force centrifuge)
L'équation à appliquer est :
ACR (en g) = 0,00001118• rayon en cm• nombre de tours par minute (tpm) au carré
ACR = accélération centrifuge radiale, en g,
rayon = distance horizontale entre l’axe de la centrifugeuse et le fond du tube à centrifuger, en cm.
Exemple : une centrifugeuse a un rayon de 15 cm et tourne à 3 000 tpm. L’accélération obtenue (arrondie au g) est de : ACR (en g) = 0,00001118 ⋅ 15 ⋅ 3000² = 1509 g
Cette équation montre que l’efficacité d’une centrifugeuse dépend beaucoup plus de sa vitesse de rotation (qui est prise au carré) que du diamètre du rotor.

La production de pigment par la bactérie a été vérifiée par illumination UV aux deux longueurs d’ondes disponibles sur notre lampe UV (254 nm et 365 nm).

-Dépôt sur papier et illumination sous UV à deux longueurs d'onde pour vérifier la présence du pigment

Spectre d'absorption des surnageants entre 200 nm et 400 nm (dans l'UV) et recherche de longueur d'onde d'absorption qui seraient spécifiques de la pyoverdine

Chromatographie sur couche mince des surnageants en présence d'un témoin fluorescent (fluorescéine)

Une chromatographie d’adsorption sur couche mince a été réalisée, avec comme témoin positif une solution diluée de fluorescéine prélevée au laboratoire de chimie.
CCM réalisée avec une solution peu concentrée en pigment.
À ce stade, impossible de savoir lequel des deux spots correspond à la pyoverdine.

Solvant utilisé :
-Butan-2-one (Méthyléthylcétone) : 3 volumes
-Éthano à 96 %l : 1 volume
-Acide éthanoïque glacial : 1 volume

Antibiogramme en milieu gélosé pour vérifier si la pyoverdine a un effet antibactérien comme cela a été trouvé lors des recherches (agent sidérophore)

Les recherches menées par les élèves leur ont permis de comprendre que la pyoverdine est un agent sidérophore ; ils ont donc réalisé plusieurs antibiogrammes, sur plusieurs bactéries cibles,avec les différentes solutions de pyoverdine, plus ou moins concentrées en pigment selon le mode d’obtention.

-disque imprégné de pyoverdine en haut
-témoins positifs (disques commerciaux imprégnés d'antibiotiques (amoxicilline, céfotaxime) à droite et à gauche
-disque imprégné d'eau distillée, témoin négatif en bas

Réalisation d’un tatouage avec la bio-encore obtenue

Les élèves se sont procurés de la couenne de cochon comme support de tatouage. Ils avaient initialement prévu de se faire prêter une machine à tatouer, mais n’ayant pu en obtenir, ils se sont contentés de simples aiguilles pour l’introduction, toute théorique, entre l’épiderme et le derme.

La solution la plus concentrée en pyoverdine a été mélangée (proportions qui me sont inconnues) dans de l’encre à tatouage blanche afin de mieux voir les points d’injection et améliorer le rendu final.

Plusieurs tatouages ont été réalisés, dont voici un des résultats représentant le symbole des reliques de la mort (Harry Potter !) sous lumière UV à 254 nm :