Découverte en 1883 et publiée en 1884, la coloration de Gram fait partie des fondamentaux de la bactériologie.

Cette coloration doit son nom au Danois Hans Christian Gram (1853-1938). D’abord assistant de botanique, il entreprit ensuite des études de médecine, et c’est en travaillant sur la pneumonie et la recherche de son agent infectieux qu’il développa, en deux semaines, cette coloration, encore utilisée 132 ans plus tard !

Il avait pour tâche de tester différents colorants sur des prélèvements provenant de patients décédés de diverses maladies, car les méthodes d’alors ne permettaient pas de colorer à la fois les cellules de prélèvement et les bactéries dont on souhaitait montrer la présence dans les tissus. Certains textes décrivent la découverte de Gram comme résultant d’une erreur de manipulation mais il n’y a pas de certitude à ce sujet. La dernière étape de la méthode de coloration qui porte son nom n’a peut-être pas non plus été mise au point par lui-même.

Toujours est-il que cette coloration, distinguant deux groupes de bactéries[1], les bactéries dites à Gram positif et les bactéries dites à Gram négatif, reste l’étape indispensable et préliminaire à toute identification bactérienne.

D’après Pascal Picquot (IUT Yutz-Thionville), revue l’Opéron, Juin 2015

[1] Cette dichotomie (séparation en deux) n’est pas absolue, il existe des bactéries à Gram « variable ».

Analyse a priori des risques liés à la coloration de Gram

D'après le protocole de coloration et avec le document suivant, rédiger un tableau d'analyse des risques liés à la procédure opératoire.

H225       Liquide et vapeurs très inflammables
H226       Liquide et vapeurs inflammables
H312       Nocif par contact cutané
H314       Provoque des brûlures de la peau et des lésions oculaires grave
H315       Provoque une irritation cutanée.
H319       Provoque une sévère irritation des yeux.
H412       Nocif pour les organismes aquatiques, entraîne des effets à long terme
H351       Susceptible de provoquer le cancer.
H335       Peut irriter les voies respiratoires
P210       Tenir à l’écart de la chaleur/des étincelles/des flammes nues/des surfaces chaudes. — Ne pas fumer
P260       Ne pas respirer les poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/aérosols.
P261       Éviter de respirer les poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/aérosols.
P280       Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de protection des yeux/du visage.
P281       Utiliser l'équipement de protection individuel requis.
P305+P351+P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer.
P273       Éviter le rejet dans l'environnement.
P501       Éliminer le contenu/récipient conformément à la réglementation locale/régionale/nationale/ internationale

Comprendre les étapes de la coloration de Gram

La vidéo suivante présente les étapes ainsi que le principe de la coloration de Gram tel qu'il est enseigné depuis des dizaines d'années (vidéo en anglais sous-titrée)

Toutefois, des études récentes semblent montrer que le cristal violet, utilisé lors de la coloration primaire, ne pénetrerait pas dans le cytoplasme mais resterait en fait piégé au niveau de la paroi.

Ce site propose une simulation de la coloration de Gram pour différentes espèces bactériennes :

• Observer les morphologies (coque, bacille, coccobacille) .
• S’entrainer virtuellement à la réalisation de la coloration
  • Déplacer successivement chaque réactif au-dessus du frottis (sur la lame)
  • Ajouter chaque réactif en appuyant sur la barre espace et en suivant les explications dans la cadre en haut à droite.
  • Laisser couler chaque réactif assez longtemps pour que la coloration soit stable.

• Pour chaque étape, noter (ou rechercher)
  • le nom de l'étape
  • le nom du réactif
  • la durée de coloration (attention : on trouve des durées différentes selon les sources)
  • la couleur de la cellule après chaque étape

Réalisation de frottis fixés colorés au Gram de souches de référence

Suspension bactériennes fournies (cultures de 18 h en bouillon nutritif ordinaire BNO) par binômes 

Chaque élève réalise sur une même lame (cf. démo) deux frottis fixés suivis d’une coloration de Gram pour chacune des deux souches souche, observe (objectif x100, huile à immersion) et estime la taille de chaque bactérie avec un micromètre-oculaire.

Expliquer à quoi correspondent des micro-organismes de classe 1.

Décrire à l'aide de la fiche technique "Coloration de Gram : critères observables", le résultat de chaque observation sous forme de tableau comparatif (à reproduire) :

Établir un tableau résumant les points communs et les différentes entre les parois des bactéries à Gram positif et à Gram négatif.

Exemple de coloration (MO, x1000) :

Ralisation de frottis fixés colorés au Gram de mélanges bimicrobiens

Exemple de frottis fixés colorés au Gram (photographies prises par des élèves sur leurs préparations ; la qualité des photos est nettement inférieure à la qualité réelle de la coloration observée au microscope) :

Escherichia coli