Objectif : réaliser un contrôle qualité (vérification de la composition de la solution d’une ampoule par chromatographie échange d’ions) d'une suspension buvable d'acides aminés .

Rappels sur le principe (fiche à télécharger : les méthodes chromatographiques)

Première partie - Séparation par chromatographie échangeuse d’ions

Contrairement à une chromatographie analytique (comme la chromatographie sur couche mince) qui ne permet que de séparer les composés d'un mélange (selon leur vitesse de migration différentielle) dans le but de les identifier, une chromatographie préparative permet en plus de les récupérer.

La chromatograpie mise en oeuvre est une chromatographie sur colonne (colonne = support) avec une résine échangeuse de cations Amberlite IRC 50 (Sigma-Aldrich), donc une chromatographie d'absorption en trois étapes (fixation - lavage - élution).

Voici la fiche descriptive que l'on peut trouver sur le site de Sigma-Aldrich concernant la résine Amberlite IRC-50 :

Soit, en résumé :

La vidéo suivante présente une séparation d'anions sur une résine cationique :

Le mélange d'acides aminés étudié contient de l'acide aspartique et de la la lysine.

Les différents pKa (indication de la « constante d'acidité » ; il est utilisé pour déterminer la force d’un acide. Plus l’acide est fort, plus le pKa de l’acide est petit) des groupements ionisables des acides aminés à séparer sont présentés ci-dessous :

À  l’aide de ces informations et du tutoriel vidéo suivant :

Construire le diagramme d’ionisation de chaque acide aminé (i.e. les formules des espèces prédominantes dans chacun des domaines de pH délimités par les pKa).

Déterminer le pHi de chaque acide aminé.

À l’aide des documents fournis, indiquer si la résine Amberlite IRC-50 permet de réaliser une chromatographie échangeuse d’anions ou de cations. Justifier.

Déterminer la charge globale et le comportement théorique des deux acides aminés lors de leur passage dans la résine à pH 4,2.

Déterminer la charge globale et le comportement théorique du (ou des) acide(s) aminé(s) précédemment fixé(s) lors du passage de la solution d'élution (solution de NaOH, pH > 12).

Réaliser un schéma de la colonne pour les différentes étapes de la chromatographie.

A l’aide des procédures opératoires, réaliser une analyse a priori des risques liés à la procédure opératoire :
- danger(s) (réactif, concentration si connue, signification des pictogrammes)
- nature du risque
- voies d'exposition
- situations exposantes (au danger)
- événénement dangereux
- dommages possibles
- mesures de prévention collective et individuelle.

La colonne fournie est constituée d’une résine IRC 50 Amberlite régénérée (résine greffée avec des groupements acides carboxyliques). Elle est placée dans un tampon acide éthanoïque-éthanoate pH 4,2 de concentration 0,1 mol.L^-1. Les généralités des techniques chromatographiques sont présentées dans le cours, le principe de la chromatographie échangeuse d’ion est présenté dans le document 4.

Préparation de la colonne déjà réalisée par les préparateurs
-Utiliser des colonnes de chromatographie (1,5 cm de diamètre et 40 cm de hauteur) avec filtre en verre fritté et robinet ou placer au fond de la colonne un tampon de laine de verre.
-Verser lentement la résine (en suspension dans du tampon acétate de sodium pH 4,2) de manière à obtenir une colonne de résine de 7 à 10 cm de hauteur. Le robinet doit être ouvert (1 goutte toutes les 5 secondes) afin de répartir régulièrement la résine et en ayant soin de maintenir la résine toujours recouverte de liquide.
Éviter les bulles d'air. Pour enlever les bulles d'air, tapoter les colonnes avec un agitateur muni d'un embout en caoutchouc
-Mettre une pastille de laine de verre sur la surface de la résine en l’introduisant dans le tampon avec une canne de verre, afin d’éviter toute bulle d’air et de maintenir la surface de la résine horizontale.
-Abaisser le niveau du liquide de manière à amener le ménisque à la surface de la résine.
Ne jamais laisser la colonne à sec : liquide toujours présent au-dessus de la surface de la résine.

Chromatographie
-Préparer 15 tubes jaugés à 5 mL, numérotés de 1 à 15 et comportant le numéro de la paillasse.
-Disposer sous la colonne le premier tube jaugé.
-Déposer très délicatement, à l'aide d'une pipette et le long de la paroi, 1 mL du mélange d’acides aminés à séparer à la surface de la résine (la surface doit rester plane).
-Régler la vitesse d'écoulement : 1 goutte toutes les 3 secondes, pas plus.
-Juste avant que le volume déposé n’ait complètement pénétré dans la résine, déposer, tout aussi délicatement 1 mL de tampon acétate de sodium pH 4,2 sans jamais fermer l’écoulement.
-Lorsque le tampon a pénétré dans la résine, faire passer 5 mL de ce tampon pH 4,2.
Vérifier la vitesse d'écoulement (1 goutte toutes les 3 à 4 secondes). Ne pas laisser la colonne à sec.
-Recueillir le filtrat dans les tubes jaugés par fraction de 5 mL en respectant l'ordre de numérotation des tubes
-Lorsque tout le tampon pH 4,2 est passé, noter le numéro du tube présent sous la colonne. Verser alors délicatement 10 mL de solution d'hydroxyde de sodium à 1 mol.L^-1, sur la colonne, la faire pénétrer dans la colonne, puis faire passer 6 fois 10 mL de cette solution d'hydroxyde de sodium.
Vérifier la vitesse d'écoulement (1 goutte toutes les 3 à 4 secondes).Ne pas laisser la colonne à sec.
-Recueillir l'éluat dans les tubes jaugés à la suite du filtrat dans les mêmes conditions.

Récupération de la résine
-Rincer la colonne avec de l'eau distillée.
-Vider la colonne en remettant la résine en suspension dans le tampon pH 4,2 . 

ELIMINATION DES DECHETS :
-Les tampons de différents pH, la soude et les restes des différentes fractions sont éliminés dans un bidon de neutralisation.
-Les réactifs à la ninhydrine et le mélange réactionnel sont éliminés dans le bidon organique non halogéné.

Etapes de la chromatographie :

Analyse colorimétrique des fractions : dosage des acides aminés à la ninhydrine
-Préparer 15 tubes à essais en pyrex numérotés de 1 à 15.
-Prélever 1 mL de chacun des tubes jaugés et verser dans le tube en pyrex correspondant.
-Ajouter dans chaque tube :       - 0,5 mL de tampon acétate de sodium pH 5,5.
                                                            - 1 mL de réactif à la ninhydrine.
-Réaliser le blanc réactif E composition du tube à déterminer et à indiquer sur le rapport.
-Boucher les tubes avec du coton cardé recouvert de papier aluminium et porter au bain-Marie pendant 15 min (exactement).
-Refroidir les tubes dans un bain d'eau froide.
-Ajouter dans chaque tube 1,5 mL de mélange éthanol à 50 % (V/V) et homogénéiser les tubes.
-Lire l’absorbance à 570 nm contre le blanc réactif.

ur chaque fraction recueillie sous la colonne (5 mL par tube), on effectue un dosage colorimétrique à la ninhydrine (fiche toxicologique).

L'absorbance est mesurée contre un blanc réactif adapté ; un histogramme A _{à 570 nm} = f(numéro du tube) permet de visualiser les fractions contenant un acide aminé.

1. Réaliser un tableau de mesures selon le modèle suivant.

Mettre autant de signe « + » que l’intensité de la coloration est importante.

2. Justifier la composition du tube 0, ou blanc réactif, de la fiche protocole 2.

3. Tracer les diagrammes suivants :
- intensité de la couleur = f(numéro du tube)
- A _{mesurée à 570 nm contre blanc réactif} = f(numéro du tube).

4. Analyser le diagramme d’élution.

5. En déduire dans quel(s) tube(s) se trouve la lysine et l’acide aspartique.

6. Proposer une méthode d’analyse qualitative permettant de vérifier la présence ou l’absence d’autres acides aminés non désirés dans cette préparation.

Exemple de présentation des valeurs mesurées (histogramme à barre numéro 1)

L'analyse théorique préalable permet de prévoir quel acide aminé est présent dans les tubes 1 et 2 et quel acide aminé est présent dans le tube 11.

Notons les valeurs mesurées d'absorbance et comparons avec l'étiquettage de la solution d'acides aminés :
100 mg d'acide aspartique et 500 mg de lysine pour 100 mL.

Les valeurs d'absorbance sont-elles cohérentes avec la composition du mélange ?

Toutefois, on obtient parfois des résultats plus délicats à interpréter :

Expliquer comment :
-Mesurer l'absorbance dans les tubes 5, 6, 8, 9 et 10.
-Déterminer le contenu des tubes 5, 6, 8, 9 et 10.

Troisième partie - Identification des composants élués par chromatographie sur couche mince

Le principe de la CCM a été abordé dès la classe de Première : http://droguet-sebastien.e-monsite.com/pages/activites-technologiques-1ere-2015-2016/at14-ccm-glucides-du-lait.html

Préparation de la chromatoplaque

• Réactiver la plaque 30 minutes à 100°C.
• Nettoyer à l’alcool la règle et porter des gant pour manipuler la chromatoplaque.
• Au crayon, tracer légèrement une ligne de dépôt à 2 cm du bord inférieur de la chromatoplaque.
• Marquer les emplacements des dépôts, régulièrement espacés, en laissant 0,5 cm sur chaque bord.

2. Préparation de la cuve

• Verser le solvant pour chromatographie au fond de la cuve de migration (hauteur : 1 cm).
• Attendre la saturation. Pour améliorer la saturation, la cuve peut être chemisée avec du papier filtre.

3. Dépôts

• Utiliser des capillaires en verre pour réaliser les dépôts (ou une P10 réglée sur 1 µL MAIS SANS DELIVRER LE VOLUME.
• Réaliser des dépôts les plus petits possibles (diamètre 2 mm) et sécher immédiatement avec un sèche-cheveux, pour limiter au maximum leur étalement.
• Effectuer chaque dépôt trois fois pour les étalons et le mélange et six fois pour les deux éluats retenus.

4. Développement du chromatogramme (=migration)

• Mettre en place la plaque dans la cuve.
• Laisser migrer jusqu’au moment où le front de solvant atteigne 1 cm du bord supérieur de la plaque.
• Sortir le chromatogramme, le placer horizontalement sur un papier filtre placé sous la hotte.
• Marquer le front du solvant immédiatement au crayon à papier fin.
• Laisser sécher la chromatoplaque sous la hotte.

5. Révélation

• Pulvériser, sous la hotte, la solution révélatrice des acides aminés (SECURITE !).
• Laisser sécher sur un papier filtre, à l’endroit.
• Placer ensuite 5 minutes à 100 °C.
• Répéter l’opération si nécessaire.
• Entourer les spots précisément.

La verification des eluats issus de la chromatographie echangeuse de cations destinée à controler la presence des acides amines à séparer (lysine et acide aspartique) n'a pas fonctionné... etalons de lecture, melange et acides aminés séparés n'ont pas migré sur le gel de silice...
L'occasion de rediger un diagramme d'Ishikawa :

Comparaison de la même CCM réalisée avec l'ancien solvant et celui préparé extemporanément :

La comparaison de l'efficacité du solvant répond-elle à ce qui était envisagé dans le diagramme d'Ishikawa ?

Exemple de chromatographie obtenue dans le cadre de la vérification de la composition du mélange et des deux fractions récupérées en sortie de colonne.
Les spots correspondant aux tubes 4 et 11 sont à peine visibles mais bien présents (conformément à la révélation colorimétrique réalisée en cuve)

Remarque : les numéros de tubes ne correspondent pas à ceux des images ci-dessus mais le tube 4 de la CCM ci-dessous correspond au tube 2 de l'histogramme numéro 1)