Lait : analyse qualitative des glucides par chromatographie sur couche mince

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudiée.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

De manière générale, la chromatographie est une méthode d’analyse qui sépare les constituants d’un mélange par entraînement à l’aide d’une phase mobile (liquide ou gazeuse), appelée éluant, le long d’une phase stationnaire (solide ou liquide) qui porte (ou entraine) les solutés à traiter.

La phase fixe et la phase mobile doivent être non miscibles et posséder des caractères opposés afin qu’il y ait une bonne séparation des différents solutés.

Deux forces principales vont s’exercer sur les molécules de soluté :

  • la force d’entraînement : due à la solubilité du soluté dans l’éluant ;
  • la force de rétention : due à l’affinité du soluté pour la phase fixe.

Forces

La résultante de ces deux forces étant variable selon le produit concerné, chaque soluté migrera donc à une vitesse caractéristique (séparation selon la vitesse de migration)

Une chromatographie peut être :

  • qualitative : si elle permet d’identifier les solutés ;
  • préparative : si elle permet de récupérer les solutésaprès séparation ;
  • quantitative : si elle permet de quantifier les solutés après séparation.

 

1ère partie : principe de la chromatographie d’adsorption sur couche mince (CCM)

  • "couche mince" : le support solide de la séparation est constitué par une très fine couche de silice sur laquelle seront déposés les témoins (ou étalons) de lecture et les mélanges à séparer
  • "adsorption" : fixation (rétention) qui s'établit entre la silice et les solutés sous l'action de liaisons électrostatiques (= liaisons faibles : forces de Van der Waals, interactions des dipôles, liaisons hydrogène...).
    On dit que les solutés sont adsorbés sur la silice ou encore qu’il s’agit d’une chromatographie d’ADSORPTION. Ces forces électrostatiques représentent la force de rétention

Attention ! ne pas confondre avec "adsorption" : pénétration à l’intérieur de quelque chose (ex. les nutriments dans le sang, après digestion)

 

Le document suivant (extrait du livre "Biotechnologie - classe de Terminale STL", éditeur Casteilla, montre un exemple de chromatoplaque

315aae30 6648 4492 95ef b31df6709b43

 

 

2ème partie : réalisation de la séparation chromatographique des constituants d'un mélange

Voici les différentes étapes à mettre en œuvre :

1) Préparation de la phase stationnaire : ré-activation de la plaque de silice à 100°C pour éliminer les molécules d'eau éventuellement adsorbées sur la silice et dont la présence modifierait le type de chromatographie (un gel de silice contenant de l'eau mettrait en oeuvre un principe de partage et non d'adsorption)

2) Préparation de la phase mobile : saturation de l’atmosphère de la cuve contenant le solvant à l'aide d'un couvercle fermant la cuve de façon étanche ; la saturation 

3) Dépôt des échantillons : solutions témoins (ou étalons de lecture) et mélange(s) à analyser sont déposés sous forme de microgoutellettes ; le dépôt doit être suffisamment concentré pour être visible lors de la révélation mais les tâches (spôts) doivent être de petite taille

4) Développement de la plaque : autre terme désignant l migration du solvant sur la plaque le long de la phase solide. Doit être stoppée avant que l'éluant ne parvienne au niveau du bord supérieur de la plaque, suivi du marquage immédiat du front de migration de l'éluant.

5) Révélation : les solutés à séparer sont le plus souvent incolores, donc invisibles à l'oeil nu ; la révélation consiste donc à les faire apparaître à l'aide d'un réactif spécifique aux molcules séparées, ou bien par l'utilisation de lumière UV (exemple ci-dessous : révélation de la caféine sous lumière UV)

Ccm cafeineuv

6) Relevé de la forme, de la couleur et des distances de migration : de chaque soluté et du front de migration)

7) Calcul du rapport frontal : c'est le rapport entre la distance parcourue par le soluté sur la distance parcourue par le solvant au niveau du front de migration

8) Interprétation et conclusion

 

3ème partie : exploitation du chromatogramme

Exemple de chromatographie sur couche mince des glucides :

"La" : étalon lactose à 4 g.L-1

"Gl" : étalon lactose à 4 g.L-1

"FD" : lait "facile à digérer", lait ayant subi un ajout de lactase par le fabricant et préalablement déféqué (précipation des protéines en milieu acide)

"UHT" : lait 1/2 écrémé stérilisé par Ultra Haute Température et préalablement déféqué (précipation des protéines en milieu acide)

"Sa" : étalon saccharose à 4 g.L-1

"Ga" : étalon galactose à 4 g.L-1

 

CCM glucides laits

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Exemple de détermination des Rf (Rapports frontaux)

Ccm glucide exploitation

 

Sur cet exemple, une consigne de préparation n'a pas été respectée. Laquelle ?

 

Exemple de présentation des valeurs :

Tableau valeurs

Commentaires (7)

Mirna
  • 1. Mirna | 11/12/2017
Bonjour
Merci pour votre réponse .
Je vais essayer de réaliser cette expérience la semaine prochaine
Bien cordialement
droguet-sebastien
  • 2. droguet-sebastien (site web) | 06/12/2017
Avez vous procédé à une défécation (élimination des protéines du lait) ?
Durand
  • 3. Durand | 06/12/2017
Bonjour,
nous avons réalisé la chromatographie la semaine dernière, mais ça n'a pas marché car le lactose et le glucose ont trop monté et les laits pas assez.
Merci quand même
Alice Durand
droguet-sebastien
  • 4. droguet-sebastien (site web) | 05/12/2017
Voici deux exemples de révélation : http://droguet-sebastien.e-monsite.com/pages/activites-technologiques-terminale-2014-2015/at06.html
- l'aniline donne de belles colorations mais les risques liés à l'utlisation de ce réactif (cf fiche toxicologique de l'INRS : http://www.inrs.fr/publications/bdd/fichetox/fiche.html?refINRS=FICHETOX_19 mènent à ne plus l'employer en prébac.
- une alternative consiste à substituer l'aniline par du permanganate ; c'est moins joli, mais les risques sont limités.

Il convient de mettre en oeuvre les neufs principes de prévention suivants, régis par l'article L4121-2 du code du travail : https://www.legifrance.gouv.fr/affichCodeArticle.do?idArticle=LEGIARTI000006903148&cidTexte=LEGITEXT000006072050

1° Eviter les risques ;

2° Evaluer les risques qui ne peuvent pas être évités ;

3° Combattre les risques à la source ;

4° Adapter le travail à l'homme, en particulier en ce qui concerne la conception des postes de travail ainsi que le choix des équipements de travail et des méthodes de travail et de production, en vue notamment de limiter le travail monotone et le travail cadencé et de réduire les effets de ceux-ci sur la santé ;

5° Tenir compte de l'état d'évolution de la technique ;

6° Remplacer ce qui est dangereux par ce qui n'est pas dangereux ou par ce qui est moins dangereux ;

7° Planifier la prévention en y intégrant, dans un ensemble cohérent, la technique, l'organisation du travail, les conditions de travail, les relations sociales et l'influence des facteurs ambiants, notamment les risques liés au harcèlement moral et au harcèlement sexuel, tels qu'ils sont définis aux articles L. 1152-1 et L. 1153-1, ainsi que ceux liés aux agissements sexistes définis à l'article L. 1142-2-1 ;

8° Prendre des mesures de protection collective en leur donnant la priorité sur les mesures de protection individuelle ;

9° Donner les instructions appropriées aux travailleurs.

Substituer l'aniline par le permanganate répond au principe n°6.
Mirna
  • 5. Mirna | 05/12/2017
Bonjour
je voudrai réaliser cette expérience avec mes eleves
mais je n'arrive pas à avoir une belle révélation de la CCM. Quel réactif de révélation utilisez vous ?
Merci par avance
cordialement
droguet-sebastien
  • 6. droguet-sebastien (site web) | 22/11/2017
Bonsoir,

Voici deux éluants qui sont des mélanges de solvant pour lesquels je vous invite à rechercher les fiches de sécurité (FDS) afin de vérifier si vous avez l'équipement nécessaire pour les utiliser :

• solvant glucide 1 :
méthyléthylcétone (butanone) 3 Volumes
acide éthanoïque 1 Volume
éthanol 1 Volume

• solvant glucide 2 :
n-butanoi 5 Volumes
isopropanol 3 Volumes
eau distillée 1 Volume

Le solvant 1 migre très rapidement (15 min) et la séparation est correcte
Le solvant 2 migre trois fois plus lentement
=> à tester, comparer en terme d'efficacité de séparation et choisir en fonction du temps disponible


Durand
  • 7. Durand | 22/11/2017
Bonjour,
Pour notre épreuve de TPE, avec mon groupe nous souhaiterions réaliser à la chromatographie de différents laits (nous travaillons sur l'intolérance au lactose ) mais nous n'arrivons pas à trouver le bon éluant, pouvez vous me dire ce que vous avez utilisé ?
Merci d'avance
Alice Durand

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Date de dernière mise à jour : 19/10/2017

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