Immobilisation d'enzyme et température optimale

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Extraire des enzymes comme les peroxydases peut se faire à très bon marché, en utilisant des légumes comme les radis nou navets, comme réalisés dans l'AT09.

Après avoir déterminé les vitesses de transformation et l'activité enzymatique totale et spécifique, l'objectif est ici de déterminer la température optimale d'activité de la peroxydase de radis noir et de démontrer que les enzymes peuvent être réutilisées plusieurs fois (dans la mesure où elles se retrouvent intactes en fin de réaction).

Pour ce faire, la technique mise en oeuvre est l'immobilisation de la peroxydase extraite à l'intérieur de billes d'alginate (lien vers un pdf donnant plus d'explications).

Remarque : l'aglinate est aussi utilisé comme additif alimentaire (E401), notamment dans les boissons ; il améliore leur texture  en éliminant les protéines indésirables et est utilisé comme émulsifiant et gélifiant.

1. Préparation de la solution d'alginate à 1 % (m/V) à partir de poudre d'acide alginique

Immobilisation pod 1

 

2. Préparation du mélange solution d'alginate + peroxydase

Aucune difficulté particulière. Après une pesée d'une masse malginate permettant de préparer 100 mL d'une solution à 1% (m/V), il faut dissoudre la poudre d'acide alginique dans de l'eau en veillant à l'incorporer progressivement sous agitation énergique. En cas de grumeaux, les écraser avec le dos de la spatule et mélanger jusqu'à obtenir la dissolution totale.

 

3. Fabrication des billes d'alginate +incluant la peroxydase

Les billes d'alginate sont formées en faisant tomber des gouttes de mélange (alginate/POD) dans une solution de chlorure de calcium.

Immobilisation pod 2

 

Cette sphérification permet d'emprisonner un liquide (ici la solution d'extrait enzymatique de peroxydase de radis noir) dans une sphère gélifiée.
La solution de chlorure de calcium crée une couche gélifiée qui s'épaissit vers l’intérieur. Ces sphères sont toutefois instables dans le temps, et une perte d'enzyme aura donc lieu par de simples phénomènes de diffusion.

 

2. Détermination de la température optimale d'activité de la POD de radis & ré-utilisation des billes 

Un premier cycle de réaction catalysée par la POD incluse dans les billes d'alginate est réalisée par différents groupes-élèves aux températures suivantes :

- 0°C
- 20°C (RT = room temperature)
- 30°C
- 40°C
- 50°C

Photo des billes après un premier cycle d'utilisation : on constate qu'elles sont conservée la couleur du produit chromophore et ce même après rinçage, indiquant qu'une partie du produit formé est resté emprisonné dans la bille.

Immobilisation pod 3

 

 

Remarque : une variante de fabrication des billes peut être réalisée : la sphérification inversée. Dans cette variante, la solution enzymatique à tester est mélangée non pas à la solution d'alginate, mais dans la solution de chlorure de calcium. Ce mélange est ensuite versé au goutte à goutte dans la solution d'alginate ; celui-ci se gélifie alors instantanément autour de la goutte de mélage (chlorure de calcium/enzyme), qui se retrouve donc emprisonnée au sein d'une couche d'alginate gélifiée.

Voici un schéma (lien de la source) présentant cette variante :

Spherification inversee

 

Ces techniques sont celles utilisées dans les techniques de cuisine moléculaire !

 

Analyse des valeurs mesurées :

Détermination de l’activité de la POD de radis noir après immobilisation par inclusion en billes d’alginate à 30°C

Immobilisation pod valeurs 30 c

Que peut-on constater ?

1er cycle : une phase de latence qui correspond vraisemblablement  au temps nécessaire à la diffusion du substrat à l’intérieur de la bille (dont le cœur liquide emprisonne l’enzyme).
Ensuite la réaction a lieu à vitesse constante et maximale (début de la période initiale à t = 70 secondes).
Les 3 dernières valeurs peuvent s’expliquer par une homogénéisation insuffisante du milieu réactionnel.

2ème cycle : une phase de latence plus longue,  pouvant s’expliquant par le fait que du produit a pu rester emprisonné dans les billes. Ensuite la réaction se déroule à vitesse maximale et constante, et la pente semble être la même que lors du 1er cycle. Il faut donc les calculer et les comparer.

Pentes ΔAt :

  • Cycle 1 : ΔAt = (1,2 – 0,2) / (150-70) = 0,0125 s-1
  • Cycle 2 : ΔAt = (1,3 – 0,35) / (210-150) = 0,0158 s-1

On peut constater que les deux valeurs de pentes sont très proches.

Conclusion : cette technique d'immobilisation permet de prouver expérimentalement que les enzymes se retrouvent intactes en fin de réaction et sont donc réutilisables.
En effet, ce sont les mêmes billes qui ont été utilisées lors des deux cycles, aucun nouvel apport d'enzyme n'a été effectué.

 

Détermination de l’activité de la POD de radis noir après immobilisation par inclusion en billes d’alginate à différentes températures

Immobilisation pod valeurs autres temp

 

Que peut-on constater ?

  • Les courbes ont globalement le même aspect : on peut déterminer la période initiale pour chaque température, elles sont globalement proches.
  • Les valeurs pour le 1er cycle à 30°C n’ont pas été placées sur ce graphe car les absorbances mesurées sont bien plus importantes (1,3 contre 0,25 pour la valeur la plus élevée).
    Les courbes pour les autres températures auraient été "aplaties" par l'échelle. Ceci permet donc immédiatement de déterminer la température optimale de travail de cette enzyme.
  • La pente la plus faible est obtenue à 0°C ; toutefois l’activité de la peroxydase n’est pas nulle.
  • La vitesse de réaction augmente pour 20°C, est maximale pour 30°C, diminue pour 40°C mais augmente à nouveau pour 50°C !
    Ceci peut s’expliquer qu’à cette température, les phénomènes de diffusion de molécules (substrat notamment) sont bien plus importants et davantage de substrat est apporté à l’enzyme ; par ailleurs, le groupe ayant travaillé à cette température a pu constater que les billes étaient devenues très fragiles et s’étaient, pour la moitié d’entre elles, déchirées après le premier cycle.
  • La calcul des pentes en période initiale permettrait de tracer un graphe secondaire : pente = f(température).

 

 

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Date de dernière mise à jour : 11/02/2017

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