Caractérisation par bio-informatique des peroxydases étudiées

Recueil d'informations utilisant le portail EXPASY, serveur de l'Institut suisse de bioinformatique permettant l'analyse de la séquence et de la structure des protéines. Ce serveur fonctionne en collaboration avec l'EBI (Institut européen de bio-informatique).
ExPASy produit également la base de connaissance UniProtKB/Swiss-Prot sur la séquence des protéines.

Relevé des caractéristiques de deux peroxydases

• Entrer le mot « Expasy » dans un moteur de recherche.
• Cocher « Proteins & proteomes » site « UniprotKB.Swiss-Prot ».
• Cliquer sur la base de données intitulée « Browse the ressource website ».
• Entrer le nom « horseradish peroxidase » dans la zone de requête puis cliquer sur "search". 
• Rechercher la protéine P80679 puis cliquer directement sur ce numéro d’identification.
  La page de description de cette protéine sélectionnée apparaît.
• Relever le numéro E.C. de l’enzyme qui est donné dans la zone « Names and Taxonomy ».
• Utiliser le lien hypertexte pour trouver la description des enzymes portant ce code.
• Dans un moteur de recherche, saisir "nomenclature EC" et rechercher la signification des quatre chiffres du code EC ainsi que la classification en sept classes des enzymes.
• Sur la page de la protéine P80679, relever le nombre de résidus d’acides aminés de cette proxydase dans la zone « Sequence » / « Length »
• Relever la masse molaire, exprimée en Daltons, et donner son équivalent en g.mol^-1.
• Relever la réaction catalysée par l’enzyme qui est donnée dans la zone « Function », sous-rubrique « catalytic activity ».
• Relever le(s) rôle(s) de l’enzyme donné(s) dans la zone « Function ». Traduire à l’aide d’un dictionnaire en ligne si besoin, vérifier la cohérence de la traduction.
• Relever le(s) nom(s) et la (les) position(s) du(des) résidu(s) d’acides aminés impliqué(s) dans le site actif dans la zone dans la zone « Function », sous-rubrique « Sites ».
• Enregistrer la séquence en acides aminés de la peroxydase P80679, située dans la rubrique « Sequence » en utilisant le format « FASTA » : cliquer sur « FASTA », copier-coller la séquence dans le Bloc-Notes, enregistrer sous le nom "POD radis blanc".
• Recommencer l’intégralité de la procédure pour la peroxydase de navet (turnip peroxidase Brassica rapa - Acces number : P00434). Copier-Coller la séquence FASTA dans un nouveau document Bloc-Notes et l’enregistrer sous le nom "POD navet".

Structure primaire et site actif de la peroxydase de radis blanc (acces number P80679 dans la base de donnée Uniprot.org)
l'acide aminé impliqué dans le site actif est une histidine (H) surligné en jaune)

Représentation de la structure tridimensionnelle de la peroxydase de radis blanc :
image reconstitué après étude par cristallographie aux rayons X, montrant également les structures secondaires (hélices alpha)

Alignements de séquences de deux enzymes
Il s’agit de comparer deux ou plusieurs séquences, acide aminé par acide aminé, afin de repérer des homologies de séquence.

• Entrer le mot « PBIL Clustalw » dans un moteur de recherche ; choisir l’adresse :

https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_clustalw.html

• Dans la fenêtre vide, coller la séquence de la POD de radis au format FASTA.
• Aller à la ligne ajouter la seconde séquence.
• Cliquer sur « SUBMIT » ; l’algorithme d’alignement compare et aligne les séquences.
• Rechercher le pourcentage d’identité entre les deux séquences.
• Les symboles de comparaison des séquences sont :

Séquence protéique au format FASTA permettant de comparer plusieurs séquences protéiques par des logiciels de comparaison de séquence en ligne

Procédure d'extraction des peroxydases

Réactifs et matériel

• Légumes : radis noirs, radis roses, navets, chou-fleur, panais… un légume par groupe PTA
• Mortier + pilon + sable de Fontainebleau (micro-sable à granulométrie fine (< 350 µm), extra-siliceux et de grains ronds à sub-anguleux).
• Tampon P (tampon phosphate à pH 7,5), conservé dans la glace.
• Matériel pour filtration : entonnoir, chinois, gaze, potence.
• Verrerie usuelle : béchers, pipettes graduées, éprouvette de 50 mL, tubes de centrifugation…
• Petit matériel : papiers filtre, pipettes d’ajustage …
• Flacon de 50 mL pour congélation de l’extrait produit
• GLACE PILEE

Préparation de l’extrait de peroxydase

• Peser à peu près exactement une masse m_légume = 25 g
• Découper en petits morceaux è Peser et noter la masse exacte.
• Utiliser le moyen de lyse mécanique mis à disposition pour broyer les morceaux, riches en peroxydase, en présence de 25 mL de tampon P glacé.
• Filtrer le broyat obtenu sur une gaze fine ou un chinois positionné au-dessus d’un bécher posé sur de la glace.
• Répartir dans autant de tubes que nécessaire le filtrat
• Centrifuger à 4 °C (centrifugeuse réfrigérée) le filtrat obtenu, pendant 5 minutes, à 7 500 g si possible (faire la conversion en vitesse de rotation en utilisant la FT "Centrifugeuse").
  Récupérer l'intégralité des surnageants de chaque tube par aspiration en veillant à ne pas remettre le culot en suspension. Regrouper tous les surnageants.
• Mesurer le volume total de surnageant à l’aide d’une éprouvette graduée.
  Noter avec exactitude le volume lu sur l’éprouvette graduée.
• Transférer ce volume dans un flacon brun
• Étiqueter l’extrait clarifié de peroxydase : « EC(nom légume), m_légume,Vextrait clarifié, groupe=
• Conserver si besoin au congélateur à -20 °C jusqu’à la prochaine séance.

Justifier la nécessité d’employer un moyen de lyse mécanique.

Indiquer la nécessité de réaliser une centrifugation sur le filtrat.

Justifier la nécessité de conserver l’extrait clarifié dans la glace.

Notre centrifugeuse réfrigérée : 

Disposition équilibrée des tubes coniques dans les plots :

Centrifugation en cours :

Après centrigucation (5 minutes à 5 500 tpm), on obtient un culot de débris cellulaire et un surnageant pour lequel l'activité enzymatique de la peroxydase va être testé, soir à partir d'un extrait de radis noir, soit de radis rose, ou de navet...

Mesures et comparaisons de l'activité enzymatique de peroxydases issues d'organismes d'organismes différents

Réaction et substrat utilisés pour l’analyse des peroxydases

La peroxydase peut être dosée par mesure de son activité. Elle catalyse la réaction suivante :

Le produit chromophore formé absorbe à 470 nm (E longueur d’onde de travail à vérifier)

Son activité est mesurée à température ambiante et pH 7,5 (en tampon phosphate à 50 mmol.L^-1).

Réactifs :

• Substrat (gaïacol) de la peroxydase en tampon pH 7,5 additionné d’eau oxygénée.
• Solution de peroxydase préalablement clarifiée (EC pur).
• Tampon pH 7,5.

Préparation du poste de travail

• Régler la longueur d’onde du spectrophotomètre à la longueur d’onde de travail.
• Préparer quatre papiers Parafilm®, un chronographe, une pipette à piston de 10 µL + cônes.
• Dans quatre semi-microcuves de 1 mL, verser 1 mL de substrat tamponné à pH 7,5.
• Ajuster le spectrophotomètre à zéro avec la cuve n°1.

Déclenchement de la réaction pour chacune des 4 manipulations

• Le plus rapidement possible :

• Ajouter X µL de l’extrait de peroxydase (voir tableau ci-dessous)
• Homogénéiser immédiatement par retournement avec le Parafilm®.
• Placer la cuve dans le porte-cuve et immédiatement déclencher le chronographe

• Suivre l'évolution de l'absorbance en continu sur 3 minutes (puis enregistrer le graphe et le tableau de valeurs, format compatible Excel) ou relever l’absorbance toutes les 10 secondes pendant 3 minutes

Chaque élève d’un trinôme réalisera une des manipulations suivantes.

Justifier la nécessité d’opérer à pH 7,5.

Vérifier expérimentalement la validité de la longueur d’onde de  travail (470 nm).

Indiquer pourquoi un ordre doit être respecté pour verser les composants de la réaction.

Justifier l’augmentation de l’absorbance au cours de la réaction enzymatique.

L'activité enzymatique est suivie par méthode cinétique continue sur une durée de 3 minutes :

Mesures de l'activité enzymatique de trois peroxydases sur les extraits clarifiés purs (manipulation 2014)

Mesures de l'activité enzymatique de trois peroxydases sur les extraits clarifiés purs (manipulation 2015)

Quelle différence remarque-t-on entre les courbes de variations d'absorbance entre les mesures de l'année 2014 (substrat : gaïacol contenu dans un sirop Pulmosérum, date de péremption 12/2014) et celles de l'année 2015 (même source de substrat)?

Quelle hypothèse peut-on formuler ?

Tracer sur un même graphe : A_{chromophore à 470 nm contre tube sans enzyme} = f (temps en minutes)
pour V_{extrait enzymatique dilué} = 10 µL (manip. 2) et V_{extrait enzymatique dilué} = 20 µL (manip. 3)

Relever sur le graphe la durée des différentes phases de cette cinétique :
- la période initiale, au cours de laquelle la quantité de produit formé (de chromophore qui apparait dans le tube) est proportionnelle au temps ;
- la phase de ralentissement, où l’apparition de produit n’est plus proportionnelle au temps ;
- la phase d'arrêt, où il n'y a plus de production de produit (réaction terminée)

Calculer, dans la période initiale, la pente ΔA/Δt en min^-1 pour chacune des deux courbes.
Comparer ces deux valeurs.

 Calculer la vitesse initiale de transformation ξi  (exprimée en mol de chromogène formé. s^-1) pour chacune des conditions testées. 

Donnée : ε_chromophore = 26 600 L.mol^-1.cm^-1

Déduire l’activité z_{(de quoi : dans quoi)}, en katals, associée à chaque vitesse initiale calculée.
Préciser dans quel volume de quelle solution est contenue cette activité.

Déduire l’activité totale z_tot en katal, contenu dans la totalité du volume d’extrait pur récupéré.

Calculer l’activité spécifique z_sp en nkatal par gramme de légume initialement pesé.

Mesures de l'activité enzymatique de la peroxydase de radis noir sur des extraits dilués (manipulation 2014)

Exemple de calculs effectués a partir des valeurs mesurées :

Pour aller plus loin

Il serait pertinent de procéder à une purification de cette peroxydase pour obtenir une solution enrichie.

Il faut pour cela mettre en oeuvre des procédures unitaires de putification mais qui vont se succéder :
- précipitation des protéines au sulfate d'ammonium pour éliminer une partie des autres biolomécules contenues dans l'extrait clarifié,
- chromatographie (échangeuse d'ions puisque le pHi de cette péroxydase a été trouvé au cours de l'activité de bio-informatique ou par tamisage moléculaire puisque, là aussi, la masse molaire moléculaire de cette enzyme a pu être trouvée ; dans les deux cas, il convient de bien choisir le type de résine (échangeuse d'anions ou de cations, diamètres des pores des billes...).

chaque étape peut alors être soumise aux vérifications suivantes :

- dosage des protéines totales
- dosage de l'activité enzymatique et des grandeurs dérivés
- calculs de concentrations d'activité catalytique
- calculs de rendement et d'enrichissement