Coloration de Gram

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudiée.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

Découverte en 1883 et publiée en 1884, la coloration de Gram fait partie des fondamentaux de la bactériologie.

Cette coloration doit son nom au Danois Hans Christian Gram (1853-1938). D’abord assistant de botanique, il entreprit ensuite des études de médecine, et c’est en travaillant sur la pneumonie et la recherche de son agent infectieux qu’il développa, en deux semaines, cette coloration, encore utilisée 132 ans plus tard !

Christian gram 1

Il avait pour tâche de tester différents colorants sur des prélèvements provenant de patients décédés de diverses maladies, car les méthodes d’alors ne permettaient pas de colorer à la fois les cellules de prélèvement et les bactéries dont on souhaitait montrer la présence dans les tissus. Certains textes décrivent la découverte de Gram comme résultant d’une erreur de manipulation mais il n’y a pas de certitude à ce sujet. La dernière étape de la méthode de coloration qui porte son nom n’a peut-être pas non plus été mise au point par lui-même.

Toujours est-il que cette coloration, distinguant deux groupes de bactéries[1], les bactéries dites à Gram positif et les bactéries dites à Gram négatif, reste l’étape indispensable et préliminaire à toute identification bactérienne.

D’après Pascal Picquot (IUT Yutz-Thionville), revue l’Opéron, Juin 2015

[1] Cette dichotomie (séparation en deux) n’est pas absolue, il existe des bactéries à Gram « variable ».

1^ère partie : analyse a priori des risques liés à la coloration de Gram

D'après le protocole de coloration et avec le document suivant, rédiger un tableau d'analyse des risques liés à la procédure opératoire.

H225 Liquide et vapeurs très inflammables

H226 Liquide et vapeurs inflammables

H312 Nocif par contact cutané

H314 Provoque des brûlures de la peau et des lésions oculaires grave

H315 Provoque une irritation cutanée.

H319 Provoque une sévère irritation des yeux.

H412 Nocif pour les organismes aquatiques, entraîne des effets à long terme

H351 Susceptible de provoquer le cancer.

H335 Peut irriter les voies respiratoires

P210 Tenir à l’écart de la chaleur/des étincelles/des flammes nues/des surfaces chaudes. — Ne pas fumer

P260 Ne pas respirer les poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/aérosols.

P261 Éviter de respirer les poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/aérosols.

P280 Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de protection des yeux/du visage.

P281 Utiliser l'équipement de protection individuel requis.

P305+P351+P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer.

P273 Éviter le rejet dans l'environnement.

P501 Éliminer le contenu/récipient conformément à la réglementation locale/régionale/nationale/ internationale

2^ème partie : comprendre les étapes de la coloration de Gram

La vidéo suivante présente les étapes ainsi que le principe de la coloration de Gram tel qu'il est enseigné depuis des dizaines d'années (vidéo en anglais sous-titrée)

Toutefois, des études récentes semblent montrer que le cristal violet, utilisé lors de la coloration primaire, ne pénetrerait pas dans le cytoplasme mais resterait en fait piégé au niveau de la paroi.

Ce site propose une simulation de la coloration de Gram pour différentes espèces bactériennes :

Cliquer sur "Expérience" puis choisir la bactérie Escherichia coli :

Observer sa morphologie (coque, bacille, coccobacille) et vérifier si elle correspond à l'interprétation faite en Q4.
S’entrainer virtuellement à la réalisation de la coloration
- Déplacer successivement chaque réactif au-dessus du frottis (sur la lame)
- Ajouter chaque réactif en appuyant sur la barre espace et en suivant les explications dans la cadre en haut à droite.
- Laisser couler chaque réactif assez longtemps pour que la coloration soit stable.

Pour chaque étape, noter (ou rechercher)
- le nom de l'étape
- le nom du réactif
- la durée de coloration (attention : on trouve des durées différentes selon les sources)
- la couleur de la cellule après chaque étape
Répéter l'opération pour : Staphylococcus aureus, Lactobacillus bulgaricus.

2^ème partie : réalisation de frottis fixés colorés au Gram de souches de référence

Micrococcus luteus :

^3ème partie : réalisation de frottis fixés colorés au Gram de mélanges bimicrobiens

Exemple de frottis fixés colorés au Gram (photographies prises par des élèves sur leurs préparations ; la qualité des photos est nettement inférieure à la qualité réelle de la coloration observée au microscope) :