Objectif : réaliser un transfert horizontal d’un plasmide par le mécanisme de la transformation bactérienne

Prérequis : notions théoriques sur les transferts horizontaux.

Matériaux : souche E. coli [Amp^S], solution de plasmide pGLO à 2 ng·µL^-1.

Première partie : obtention de bactéries compétentes

Une souche d'Eschericihia coli k12 de phénotype [Amp^S] est mise en culture à 37 °C dans un bouillon LB (Lysogeny Broth ou encore Luraia-Bertani) sous agitation constante et en aérobiose dans un Erlenmeyer stérile sous agitation mécanique ou en bioréacteur de laboratoire (bulleur au maximum).

But: vérifier que la bactérie est en phase exponentielle de croissance. Pour cela :

• Mesurer l’atténuance de la suspension bactérienne à 600 nm notée D₆₀₀ par prélèvements aseptiques toutes les dix minutes.
• Tracer en temps réel le nuage de points ln D₆₀₀ = f(temps en minutes)
• Arrêter la culture quand l’atténuance mesurée est comprise entre 0,400 et 0,500 .

Donnée : la phase exponentielle est repérée par une allure de la courbe proche d’une droite (cette partie de la manipulation peut constituer un préalable à l'AT Croissance bactérienne ou bien être ralisée en même temps ou bien être effectuée après l'AT Croissance bactérienne).

Les bactéries en phase exponentielle de croissance vont pouvoir être amenées en état de compétence, c.à.d. aptes à recevoir de l’ADN exogène (ici un plasmide).

• Placer la culture pendant 15 min dans la glace.
• Prélever stérilement 5 mL de culture bactérienne dans un tube de centrifugation de 10 mL.
• Centrifuger les tubes 15 minutes à 850 g.
• Rejeter le surnageant dans un bac à eau de Javel.
• Ajouter 2,5 mL de solution de CaCl₂ à 100 mmol·L^-1.
• Remettre délicatement le culot en suspension.
• Compléter à 10 mL avec la même solution de CaCl₂.
• Laisser les tubes dans la glace pendant 15 min.

Les bactéries sont maintenant « en état de compétence » c.à.d. prêtes pour la transformation.

Vidéo à utiliser pendant les temps d’incubation pour répondre aux questions : https://youtu.be/gqpCau2xbIs?si=4E-Im2ExoCfqOS9_  

• Relever les différentes étapes de la transformation méthodes permettant de rendre une bactérie compétente.
• Relever les différentes méthodes de transformation utilisées au laboratoire.
• Repérer quelle méthode est mise en œuvre dans cette activité.
• Relever dans tous les cas le point commun aux deux méthodes.
• Relever le rôle du calcium apporté par le CaCl₂. Justifier ce rôle d’après les propriétés physico-chimiques de l’ADN, étudiées en début d’anné

Deuxième partie : transformation des bactéries 

1. Transformation des bactéries.

• Annoter deux microtubes : +pGLO et -pGLO + numéro de poste
• Introduire 1 mL de bactéries compétentes dans chacun des microtubes.
• Placer les tubes dans la glace en attendant de réaliser la suite.
• Introduire 10 µL de la solution de plasmide pGLO dans le tube +pGLO.
• Introduire 10 µL d’eau distillée stérile dans le tube -pGLO.
• Placer les deux tubes dans la glace pendant 15 minutes.
• Transférer les deux tubes de la glace vers le bain-thermostaté à 42 °C pour créer un choc thermique : laisser les deux tubes dans le bain thermostaté à 42 °C pendant 50 secondes.
• Replacer immédiatement les tubes dans la glace pendant 3 minutes.
• Ajouter ensuite dans chaque tube 900 µL de bouillon LB stérile. Homogénéiser.
• Incuber 15 à 30 minutes à 37 °C sous agitation.

Expliquer le rôle de la dernière étape.

2. Mise en culture des bactéries.

• Disposer sur la paillasse les milieux de culture suivants coulés en grande boîte de Pétri :

Pour ensemencer (Attention : changer de cône et d’ensemenceur à chaque boîte)

• Réaliser autant de pipettes-râteau que nécessaire (cf. démonstration)
• Prélever 100 µL de la suspension bactérienne et les déposer en trois gouttes à la surface de la gélose.
• Etaler avec un ensemenceur ou un râteau stérile de la façon la plus uniforme possible.
• Incuber les géloses à 37 °C pendant 24 h.

Expliquer le rôle de la gélose n°1 d’après sa composition.

Expliquer le rôle de la gélose n°2 d’après sa composition.

Expliquer le rôle de la protéine Ara et de l'inducteur arabinose.

Expliquer pourquoi le gène codant la GFP est qualifié de gène "rapporteur".

Dénombrer les colonies présentes sur la gélose n°3.

Calculer la quantité d’ADN de plasmide pGLO apporté pour la transformation.

Calculer l’efficacité de la transformation en utilisant l’équation aux grandeurs suivante, exprimée en nombre de bactéries E. coli transformées par µg d’ADN plasmidique

Eclairage sous lampe UV 365 nm sous le PSM

Comparaison des bactéries transformées exprimant la GFP grâce à la présence d'arabinose dans le milieu (le gène codant la GFP est accolé à l'opéron arabinose) avec des bactéries transformées (cultivant donc sur milieu LB complémenté en ampicilline) mais sans expression de la GFP (absence de l'inducteur arabinose dans le milieu)