Objectif : effectuer le dosage d'une biomolécule par une méthode alternative au dosage spectrophotométrique : la méthode dite de Mancini

 

L’immuno-précipitation est un phénomène au cours duquel des antigènes solubles se combinent avec des anticorps spécifiques pour former un réseau visible sous forme de précipités visibles à l’œil nu.

L’antigène soluble dans l’eau est généralement une protéine ou un polyoside : 

La réaction de précipitation est maximale pour un rapport Ag/Ac précis : le système est alors à l’équivalence, le réseau formé est complet.
La réaction de précipitation peut être inhibée par un excès d’Ac ou d’Ag, le réseau est alors incomplet: c’est le phénomène de zone (source : technique d'immunologie, CRDP édition Aquitaine)

Les réactions de précipitation sont très sensibles à ce phénomène, d’où la nécessité de travailler avec des dilutions différentes de l’Ag ou de l’Ac à étudier.

Dosage d'une biomolécule par immunodiffusion simple : méthode de Mancini (fiche à télécharger)

Le contexte est ici simulé : il s'agit d’effectuer le dosage de l'entérotoxine staphylococcique par l'utilisation d'anticorps anti-entérotoxine staphylococcique inclus dans la gélose.

La réalisation est ici également simulée  :  un artifice de préparation permet d'obtenir (en trente minutes) des anneaux de précipitations ressemblant (plus ou moins...) à des anneaux de précipitations dus à des immuns-complexes.

C’est une précipitation par diffusion simple car un seul de réactifs (Ag ou Ac) diffuse dans le milieu gélosé jusqu’à établir un gradient de concentration.

• Technique d’immunoprécipitation par simple diffusion : l’anticorps est incorporé dans une gélose qui est coulée dans une boîte de façon à obtenir un gel d’épaisseur homogène et de concentration uniforme en anticorps.
• Les anticorps sont contenus dans le gel : leur concentration est donc constante.
• Une gamme étalon de dilutions d’une solution antigénique de concentration connue est déposée dans une série de puits creusés dans le gel ; l’antigène va donc diffuser en formant un gradient de concentration concentrique (immunodiffusion radiale) décroissant en s’éloignant du puits.
• Quand la concentration atteint la zone d’équivalence avec celle de l’anticorps incorporé dans le gel, il se forme en 24 à 48 heures à température ambiante en chambre humide un anneau de précipitation, résultant de la formation d’un réseau Ag-Ac, ù la concentration en Ag est optimale par rapport à la concentration en Ac
• Le diamètre externe du cercle de précipitation au carré est proportionnel à la concentration en masse de l’antigène.

L'étalonnage de la procédure consiste à réaliser une gamme étalon permettant de relier le diamètre au carré (D²) en fonction de la concentration ; la linéarité traduisant la proportionnalité entre ces deux grandeurs, il sera possible de déterminer mathématiquement la concentration en antigène dans l’échantillon analysé 

Remarque : il n’y a pas de témoin puisqu’un Mancini (analyse quantitative) fait toujours suite à un Ouchterlony (analyse qualitative) avec lequel les mêmes réactifs sont utilisés

Matériel et réactifs :
-Gel d’agarose contenant des anticorps anti-entérotoxine coulé en petite boîte de Pétri.
-Microtubes contenant l’échantillon d'entérotoxine à doser
-Un microtube noté « Etalon » contenant une solution étalon d'entérotoxine à 5 mg·mL^-1

Préparation de la gamme d’étalonnage 

	Etalon 1	Etalon 2	Etalon 3	Etalon 4
Vsol mère entérotoxine à 5 mg.mL-1 (μL)	12,5	25	50	100
VTampon PBS  (μL)	87,6	75	50	0
ρ (toxine ; sol) en mg·mL-1	0,625	1,25	2,5	5

• Vérifier la concentration en entérotoxine dans chacune des solutions étalon (utiliser soit la la de conservation de la masse, soit les dilutions réalisées).*

• Identifier deux points critiques pour la bonne réalisation de cette technique.

océdure opératoire  

-Placer la boite au-dessus du gabarit fourni et repérer la position des futurs puits par transparence.
-Creuser les puits avec un emporte-pièce pour obtenir des puits parfaitement cylindriques et équidistants.
-La gélose est cassante, enfoncer l’emporte-pièce d’un geste franc puis effectuer une rotation pour bien séparer la pièce de gélose.
-Identifier les puits sur le bord de la boite selon le plan de dépôt imposé (noter l’identifiant, sur le bord de la boite, en petit, le plus en périphérie possible pour ne pas perturber la lecture et noter sur le carnet de laboratoire la correspondance entre l’identification et le contenu du puits).
-Réaliser les dépôts de 20 μL dans chacun des puits.
-Les dépôts doivent être minutieux.
-Si incubation longue de 24h à 48 h, tapisser l’intérieur du couvercle de la boite de Pétri d’un papier filtre imbibé d’eau puis le parafilmer.
-Incuber à température ambiante ou en chambre humide sur une surface plane.

Exemple de résultats pour la gamme :

• Reproduire et compléter le tableau suivant :  

	Étalon 1	Étalon 2	Étalon 3	Étalon 4	E1	E2
ρ (toxine ; solution) en mg.mL-1
Diamètre mesuré D en mm
D2 en mm2

• Mesurer au pied à coulisse (résolution : 0,1 mm) le diamètre de chaque anneau de précipitation.

• Tracer sur tableur-grapheur le nuage de points : D² = f (ρ_{(entéroxine  ; échantillon)} en mg·mL^-1)

• Insérer la courbe de tendance, afficher l'équation de la droite et le coefficient de détermination R².

• Déterminer, à l'aide des paramètres de la droite, la concentration en entétoxine de l'échantillon à analyser pour chacun des deux essais :
  E1 : diamètre mesuré 15,0 mm
  E2 : diamètre mesuré 15,5 mm

• Vérifier la compatiblité des valeurs mesurées (s_r = 0,1 mg·mL^-1)

• Exprimer le résultat de mesure (uc = 0,12 mg·mL^-1)

Autre exemple de résultats :