Dosage glucose (M)

Enzymologie - Dosage du glucose en point final lors d'un test d'hyperglycémie provoqué orale (M)

Objectif : effectuer un dosage colorimétrique du glucose par une méthode enzymatique très spécifique, afin de déterminer si une patiente enceinte est atteinte de diabète gestationnel.

Le suivi d’une grossesse nécessite la vérification d’un certain nombre de paramètres physiologiques, comme le montre ce tableau des examens à prescrire lors de la première consultation

Examens à prescrire obligatoirement	Glycémie (concentration en glucose dans le sang) Glycosurie (concentration en glucose dans les urines) Protéinurie (concentration en protéines dans les urines) Recherche syphilis (IST due à la bactérie Treponema pallidum) Groupe sanguin (ABO, rhésus, Kell) Recherche d’anticorps irréguliers Recherche de l’antigène HBs (hépatite B)
Examens à proposer systématiquement	Echographie (entre 11 et 13 semaines d’aménorrhées) Sérologie VIH1 et 2
Examens à prescrire éventuellement	Examen cytobactériologique des urines (ECBU) Dépistage d’une anémie (hémogramme) Dépistage de dysplasies cervicales

Source : https://www.has-sante.fr/upload/docs/application/pdf/suivi_des_femmes_enceintes_-_recommandations_23-04-2008.pdf

Selon la définition de l’OMS, le diabète gestationnel, appelé aussi "diabète de grossesse", est un trouble de la tolérance glucidique conduisant à une hyperglycémie de sévérité variable, débutant ou diagnostiqué pour la première fois pendant la grossesse. Il peut durer le temps de la grossesse ou être révélateur d'un diabète antérieur.

Symptômes

Le diabète gestationnel peut passer inaperçu, être asymptomatique (sans symptômes) ou présenter des symptômes similaires à ceux des autres types de diabète : soif intense, mictions (urines) fréquentes et abondantes, fatigue importante…

Risques pour l’enfant

Le glucose en excès chez la mère est transmis au fœtus. Cette réserve calorique excédentaire est stockée dans les organes de l’enfant. Le poids et la croissance de l’enfant à naître sont alors excessifs. Un poids à la naissance supérieur à 4kg peut entraîner un accouchement difficile. D’autres complications pour l’enfant sont possibles : détresse respiratoire, hypoglycémie néonatale, risque de développer plus tard un diabète de type 2.

Risques pour la mère

La complication la plus grave est la survenue d’une pré-éclampsie (appelée aussi toxémie gravidique) associant hypertension artérielle, protéinurie, prise de poids, œdèmes, accouchement par césarienne, risque de développer un diabète de type 2 après la grossesse (sept fois plus que sans diabète gestationnel), accouchement prématuré.

Donner la définition et l’utilité d’une solution dite « étalon de travail ».

Répondre aux questions suivantes à l’aide du document 2 :Quel est l’élément dosé ?

Quels sont les noms des enzymes permettant le dosage de la molécule à doser ?
Quel est le nom du produit coloré formé (chromophore) dont on suit l’absorbance ?
Par quelle méthode est dosé l’analyte (= molécule à analyser) ?

Recopier les équations du dosage puis indiquer :

Quelle est la réaction principale (celle dans laquelle intervient la molécule à doser) ?
Quelle est la réaction indicatrice (celle qui fait apparaitre ou disparaitre la molécule qui a des propriétés analytiques = le chromophore) ?
Quelle est la réaction intermédiaire (s’il y en a une, elle fait le lien entre les deux précédentes) ?

Déterminer la longueur d’onde de travail à laquelle doit être réalisé le dosage.

Justifier la composition du blanc réactif.
Un autre blanc réactif pourrait être réalisé : quel serait sa composition et pourquoi ?

En se basant sur la procédure opératoire décrite dans le doc. 2, réaliser un tableau de manipulation comprenant les volumes ainsi que les absorbances qui seront mesurées pour la réalisation :

d’une cuve "blanc réactif" B
d’une cuve "étalon" E
d’une cuve "contrôle" C avec la solution étalon de contrôle interne
de trois cuves "essai" : sérum de la patiente aux différents temps de la procédure.

Identifier un danger éventuel, sa nature puis présenter une situation exposant au danger.
En déduire les mesures de prévention, collectives et individuelles, à mettre en œuvre

Rechercher, à l’aide des données du document 1 et 2, pourquoi il n’est pas nécessaire de diluer les échantillons de sérum.

Identifier une source d’erreur qui pourrait compromettre la qualité du dosage du glucose et argumenter la réponse.

Réalisation pratique

Matériel et réactifs :

Pipettes à piston adaptées aux volumes à prélever + cônes adaptés
Microcuves spectrophotométriques
Spectrophotomètre
Bain thermostaté de paillasse ou étuve

Sérums de la patiente à analyser prélevés à trois intervalles de temps différents
et notés S0 S1 S2
Solution étalon E de glucose : ρ_{(glucose ; étalon E)} = 1,00 g·L^-1 (5,55 mmol·L^-1)
Solution contrôle C de glucose : ρ_{(glucose ; contrôle C)} = 1,20 g·L^-1 -6,67 mmol·L^-1)
Eau distillée
Monoréactif prêt à l’emploi (Fabricant Biolabo) de composition suivante :

Tampon phosphate pH 6,6 150 mmol·L^-1

Amino-4-antipyrine 0,8 mmol·L^-1

Chloro-4Phénol (chromogène) 140 mmol·L^-1

Peroxydase ≥ 1 000 U·L^-1

Glucose oxydase ≥ 20 000 U·L^-1

Procédure opératoire :

Réaliser le dosage du glucose par méthode enzymatique dans les solutions étalon, contrôle et dans les échantillons de sérum de la patiente, prélevés selon les modalités indiquées dans le document 1.

Pour cela, respecter les consignes de mise en œuvre indiquées dans le document 2.

Présentation et exploitation des résultats

Présenter les indications de mesure sous forme appropriée.

Calculer la concentration en masse de glucose en g·L^-1dans la solution de contrôle fournie.
Vérifier l’exactitude de mesure de la concentration en quantité de matière de glucose dans la solution contrôle C en utilisant l'aide-mémoire de métrologie et le document 2.
Valider (ou non) l'exécution de la procédure dans les conditions opératoires du jour.
Remarque : si l’exécution de la procédure n’est pas conforme, rechercher et proposer une ou plusieurs causes à l’aide d’un diagramme d’Ishikawa.

Calculer la concentration en masse de glucose en g·L^-1de sérum de la patiente enceinte après l’épreuve d’hyperglycémie provoquée orale pour chacun des prélèvements.

Calculer l’incertitude élargie U conformément aux règles de métrologie (cf. aide-mémoire de métrologie).

Reproduire et compléter le tableau suivant.

Temps après ingestion

du sirop glucosé

0 h

1 h

2 h

r_{(glucose ; sérum)} ± U en g·L^-1

Avec un niveau de confiance de 95 %