Culture cellulaire végétale (M)

Initiation à la culture in vitro de cellules végétales (M)

Objectif : réaliser une multiplication végétative in vitro d'un végétal et comprendre le rôle des phyto-hormones.

Contexte

Tout comme on peut cultiver des cellules bactériennes, il est possible de cultiver, in vitro, des cellules eucaryotes animales ou végétales. Les cellules ainsi cultivées permettent d’obtenir des tissus biologiques qui servent de modèles cellulaires pour la recherche scientifique (études toxicologiques, production d’anticorps monoclonaux, production de vaccins …)

La culture de cellules végétales est surtout réalisée dans le cadre de la micropropagation d’organismes génétiquement modifiées (OGM). Partant d'un fragment de feuille saine, on peut obtenir des milliers de plantes identiques à la plante mère et ceci dans un temps très court et indépendamment des saisons.

La multiplication végétative in vitro de Saintpaulia est un exemple remarquable du phénomène de différenciation cellulaire caractéristique du monde végétal. Obtenir une telle multiplication de plantes à partir d'un fragment de feuille serait impossible avec les techniques classiques de multiplications des végétaux (exemple : bouturage en terre, etc...) : la contamination par les bactéries du sol, les champignons et la nécrose détruirait le fragment.
En revanche, dans des conditions aseptiques, on maîtrise complètement la multiplication de la plante puisque l'on connaît, ou au besoin on peut faire varier, les conditions physiques (température, lumière, photopériode, etc.…) et la composition chimique du milieu et l'action des phytohormones. C'est l'exemple d'une biotechnologie.

Principe général

Une feuille de Saintpaulia est soigneusement désinfectée, rincée à l'eau déminéralisée stérile, découpée avec un scalpel stérie et déposée sur le milieu de multiplication adapté contenant des phytohormones.

Les milieux de culture doivent contenir des nutriments de base : sels minéraux, vitamines, macroélements et microéléments. En plus de ces nutriments, la plupart des milieux contiennent des hormones végétales ou phytohormones qui induisent la multiplication voire la différenciation cellulaire : auxine et (ou) cytokinine.
Les conditions d’incubation doivent permettre le maintien des paramètres physico-chimiques (température, luminosité, humidité) à des valeurs optimales.

Une des causes d’échecs des cultures cellulaires est la contamination par des micro-organismes. Il est donc nécessaire d’appliquer des règles d’asepsie particulièrement rigoureuses.

Après avoir étudié la composition du milieu de culture our végétal ci-dessous, compléter la colonne de droite en indiquant le rôle des constituants de ce milieu.

Composant du milieu de culture pour végétal	Rôles des constituants
KHNO₃NH₄ NO₃CaCl₂MgSO₄
MnSO₄ZnSO₄KI CuSO₄CoCl₂ FeNa Na₂MoO₄
Saccharose
Mésoinositol Pyridoxine Acide nicotinique Thiamine Biotine Pantothénate de Ca
Auxine Cytokinine
Eau
Agar

Après environ 4 à 6 semaines, sous l'effet des phytohormones présentes dans le milieu de culture, on voit apparaître un grand nombre de microfeuilles de quelques millimètres.
À ce stade, on peut diviser cette touffe en plusieurs petits plants et les remultiplier en les repiquant sur le même milieu : c'est la micropropagation. Cette opération peut être répétée plusieurs fois.

Après la phase de multiplication, on peut diviser la touffe et repiquer les petites plantules sur un milieu d'enracinement. 6 à 8 semaines plus tard, les plantules enracinées peuvent être transférées en serre pour la phase d'acclimatation

Quelles seront les conditions d’incubation nécessaires pour la micropropagation du Saintpaulia ?

Material and methods (easter egg)

Par binôme

Pour le groupe

-2 boîtes de Pétri pour la désinfection des plantes : 1 contenant de l'eau de Javel diluée au 1/5, 1 contenant de l'alcool à 70°.

-3 pots contenant de l'eau distillée stérile pour le rinçage.

-Pinces, scalpel et ciseaux.

-2 flacons de milieu de culture végétale

-1 L de « bain mouillant » : 1 L d’eau stérile additionnée de 2 gouttes de liquide vaisselle

-1 plant de Saintpaulia.

Préparation du plan de travail

Avant de manipuler, se laver soigneusement les mains et les avant-bras au savon antiseptique.
Décontaminer la paillasse.
La désinfection des feuilles de déroulera en zone d'asepsie autours du bec électrique.
Placer une boîte de Pétri stérile, les désinfectants (eau de Javel diluée, alcool à 70°), et les boîtes pour le rinçage à l'eau distillée stérile.
La mise en culture s'effectuera sous hotte à flux laminaire vertical, plus efficace pour maintenir la stérilité des produits et matériels.

Feuille de Saintpaulia (loupe binoculaire, Gt 20 fois puis 40 fois) :

Désinfection du tissu végétal

Stériliser scalpel et pinces fines (chaleur ou éthanol).
Désinfecter 4 petits béchers (adaptés à la taille de la feuille coupée).
Prélever une feuille saine et mature, c'est-à-dire située à la périphérie de la plante.
La débarrasser de son pétiole puis la laver à l’eau du robinet.

Tremper, à l’aide d’une pince stérile, la feuille dans un bécher contenant un « bain mouillant » pendant 5 min.
Rincer à l'eau du robinet.
Transférer la feuille dans un bécher contenant de l’éthanol à 70 % et agiter pendant 15 secondes.
Transférer immédiatement la feuille dans un bécher contenant une solution d'eau de Javel diluée au 1/5^e et agiter régulièrement pendant 15 minutes
➔ La feuille étant désinfectée, les étapes suivantes doivent être réalisées en milieu stérile avec du matériel stérile.
Rincer la feuille par 4 bains de 5 minutes chacun dans l'eau distillée stérile en agitant.
ATTENTION : pendant la manipulation, ne jamais toucher l'extrémité des instruments ou la plante avec les mains, ne pas parler, ne pas faire de courants d'air, bien fermer portes et fenêtres.
A l’issu du rinçage, transférer aseptiquement la feuille dans une petite boîte de Pétri stérile et refermer le couvercle

Mise en culture des explants

Désinfecter une paire de pinces fines et un scalpel.
Dans la boîte de Pétri stérile, couper 4 carrés d'environ 1 cm², de préférence à la base de la feuille et comportant une nervure. Ces carrés sont appelés explants.
Ouvrir un flacon de milieu de multiplication SP1.
Placer avec des pinces stériles deux explants, face inférieure de la feuille en contact avec le milieu de multiplication SP1 préalablement coulé inclinée dans un flacon.
Refermer et identifier les boîtes.
Sceller les couvercles avec une bande de papier Parafilm.
Placer les boîtes à une température d'environ 25 °C, horizontalement, à la lumière indirecte près d'une fenêtre ou dans une armoire de culture végétale (phototron) éclairée 12 h sur 24 h.

Après 5 jours

Multiplication des vitroplants (étape facultative)

Au bout de 6-8 semaines, l’explant (fragment de tissu qu'on prélève sur un organisme en vue de le cultiver) a gonflé et on peut voir des pousses de Saintpaulia à sa surface. Ces amas de cellules végétales peuvent être divisées puis repiquées sur un nouveau milieu SP1 pour obtenir une nouvelle multiplication = on parle de micropropagation.

Si on repique ces amas de cellules sur un autre milieu (= SP2) on peut procéder au développement des explants et à leur enracinement.

Passage sur milieu d’enracinement

Lorsque les plants se sont suffisamment multipliés, repiquer chaque plantule obtenue sur le milieu d'enracinement SP2.

Décontaminer soigneusement la paillasse (ou le PSM) et les mains.
Stériliser le scalpel et les pinces.
Couler le milieu SP2 dans une petite boite de Pétri.
Ouvrir le flacon de milieu SP1.
Sortir délicatement la touffe avec une pince stérile et la poser dans la boîte de Pétri stérile.
Isoler des plantules à l'aide d'un scalpel.
Les déposer sur le milieu SP2 en les enfonçant légèrement dans la gélose, mais en laissant la majorité des tissus à la surface
Refermer et sceller le couvercle de la petite boite de Pétri avec une bande de papier Parafilm.
Placer à la lumière indirecte près d'une fenêtre ou dans une armoire de culture végétale (phototron)

Les plantules se développent et les racines se forment. Au bout d'environ 6 semaines, lorsque les racines ses sont développées, elles peuvent être transférées en pots sou

Transfert en serre

Transférer les plantules enracinées en pots sous serre pour la phase d'acclimatation.

Placer du terreau dans des petits pots.
Prélever délicatement les plantules enracinées à partir des flacons de milieu SP2 en prenant garde à ne pas briser les racines.
Éliminer la gélose qui adhère aux racines en les trempant dans de l'eau.
Repiquer les plantules dans les petits pots.
Bien arroser.
Placer les pots dans une mini-serre.
Arroser régulièrement.