Objectif : identifier une levure reponsable d'une infection en réalisant un auxanogramme du carbone et/ou par l'utilisation dun milieu chromogénique

Les champignons microscopiques peuvent provoquer des maladies infectieuses appelées mycoses. Actuellement, ils prennent une grande importance en pathologie (infection graves, opportunistes ou chroniques de très longue durée). Suivant sa localisation, un même champignon peut donner des pathologies différentes : otite, sinusite, méningite, lésions cutanée ou pulmonaire...

Les voies de contamination sont les suivantes :

• contamination endogène : les champignons commensaux deviennent pathogènes ;
• contamination exogène : cutanée, transcutanée, digestive (rare), respiratoire (fréquent).

Parmi les levures du genre Candida, l’espèce Candida albicans est responsable de la plupart des infections fungiques, avec notamment :

• des atteintes cutanées : intertrigo, périonyxis ;
• des atteintes des muqueuses : muguet, gastro-entérites, vaginites ;
• des septicémies.

D’autres genres de levures sont également responsables d’infections : Cryptococcus neoformans (levure possédant une capsule polysaccharidique), Torulopsis glabrata…

Etude de la composition du milieu pour auxanogramme

Composition du milieu de base pour auxanogramme pour 1 L de milieu (Source Sigma Aldrich) :
Remarque : les molécules carbonées utilisées comme facteurs de croissance(*) ne permettent pas une croissance visible.

• À l’aide du document, présenter les propriétés du milieu de base pour auxanogramme.

• Les levures sont des micro-organismes chimio-organo-hététrophes.
  Définir les types trophiques correspondant à cette description.

• Comparer les exigences trophiques d’une levure avec la composition de ce milieu.

• En déduire si une levure est capable de se développer sur ce milieu.
  Justifier la réponse.

• Indiquer l’aspect attendu d’un résultat positif ; d’un résultat négatif;

• Justifier, par l’étude de la composition du milieu, la remarque faite sous le tableau de composition.

• Proposer une ou plusieurs molécules à ajouter pour obtenir une croissance sur ce milieu.

• En déduire une définition de l’auxanogramme.

Auxanogramme : macrométhode

Matériau : culture pure de la levure isolée du prélèvement vaginal, sur gélose Sabouraud + chloramphénicol.

 -Réaliser une suspension en eau physiologique stérile de turbidité équivalente à celle d'un étalon de turbidité 3 McFarland (correspond à plusieurs anses de culture)

-Incorporer 1 mL de cette suspension dans 20 mL de gélose pour auxanogramme maintenue en surfusion et ramenée à température compatible avec le survie des levures. Homogénéiser.

-Couler immédiatement la gélose inoculée et laisser solidifier le milieu.

Remarque : on peut aussi réaliser un étalement en surface de V_suspension = 0,1 mL

-Imprégner successivement et faiblement (la charge en molécule carbonée ne doit pas être importante) autant de disques de papier stériles avec 25 µL de chacun des glucides à tester : GLUcose, GLYcérol, 2KetoGluconate, ARAbinose, ADOnitol, INOsitol,
Méthy-D-Glycoside, N-Acétyl-Glycosamine, MALtose, MeLeZitose, RAFfinose.

-Disposer chaque disque sur la gélose gélifiée (contenant des levures incluses dans la masse) en utilisant un abaque.

Effectuer la lecture après 48 h d'incubation 

Résultat d'un auxanogramme réalisée sur la levure à identifier et de l'isolement réalisé en fin de manipulation à partir de la suspension de levure (opacité équivalente à un étalon de turbidité 3 Mc Farland) utilisée pour réaliser l'auxanogramme :

1. GLUcose
2. GALactose
3. MALtose
4. TREhalose
5. SACcharose
6. SORbitol

• Effectuer la lecture de l'isolement.

• Définir un résultat positif (observation et interprétation).

• Présenter les résultats des tests dans un tableau.

• Identifier la souche de levure par un raisonnement dichotomique à l’aide du tableau d'identification ci-dessous.

• Vérifier l'identification réalisée en utilisant le site :

 http://bioeluard.free.fr/api/ (choisir dans la liste déroulante la galerie API 20C Aux) ou en utlisant le talbeau ci-dessous :

Exemple de résultat :

Exercice : procéder à l'identification de cette autre levure

Auxanogramme : microméthode (galerie API 20C Aux Biomérieux)

Exercice : procéder à l'identification de ces deux levures, après mise en oeuvre de la galerie API 20C Aux

Alternative pour l'identification présomptive de quelques levures d'intérêt médical

Le milieu Candiselect 4 (Biorad) est un milieu chromogénique gélosé pour l'isolement sélectif des levures, l'identification directe de Candida albicans et l'identification présomptive de 3 autres levures du genre Candida.

Exercice : procéder à l'identification de ces deux levures, après mise en oeuvre de la galerie API 20C Aux