Objectif : vérifier la teneur en protéines présentes dans la boisson protéinée "X"  par la méthode de dosage dite du biuret.

70 % du vieillissement s'explique par l'environnement, seulement 30 % par les gènes. C'est dire le rôle de la nutrition et de l'hygiène de vie dans le bien vieillir. Il est fondamental de surveiller et préserver la masse musculaire.  Après 70 ans, une personne âgée a besoin d'apports énergétiques supérieurs de 20 % à ceux de ses trente ans du fait d'un moins bon rendement métabolique des aliments. La part des protéines dans ce total doit ainsi être augmentée.

Plusieurs fabricants proposent des boissons protéinées adaptées aux personnes âgées. L’étiquette d’un produit " X" une concentration théorique de 80 g de protéines par litre.Contexte préalable

Une dilution au 1/10^ème de la boisson protéinée a été réalisée et une première série de mesure montre que cette dilution n’est pas suffisante : les valeurs d’absorbance mesurées sont au-dessus du point le plus haut de la gamme d’étalonnage. Une seconde dilution doit être réalisée.

Calculer V_{PE BP10}, le volume à prélever de boisson protéinée déjà diluée au 1/10^ème, pour préparer 10 mL d’une solution diluée au 1/20^ème notée BP20 .

Préciser la verrerie nécessaire pour réaliser cette dilution.

Après avoir lu la partie « Réalisation pratique », répondre aux questions suivantes :

Indiquer le rôle du tube 0 de la gamme d’étalonnage et justifier sa composition.

Justifier le choix de la longueur d’onde de travail : 540 nm.

Réaliser une analyse a priori des risques liés à l’activité expérimentale : identifier un danger, une voie d’exposition et une situation exposant au danger.
Proposer si nécessaire la (les) mesure(s) de prévention adaptée(s)

Principe du dosage des protéines par la méthode du biuret

Cette méthode consiste à doser la quantité de liaisons peptidiques.
Le biuret (formule H₂N-CO-NH-CO-NH₂, soit deux molécules d’urée) donne avec les ions cuivriques Cu²⁺ et en milieu alcalin un complexe absorbant fortement à 540 nm (coloration bleue violette due à la formation du complexe Cu²⁺ - biruet).
La liaison peptidique établie entre deux acides aminés est également capable, dans les mêmes conditions expérimentales, de former un complexe avec les ions cuivriques.
Ce complexe peut être dosé par spectrophotométrie d’absorption à 540 nm.

On réalise une gamme étalon à partir d’un standard de concentration connue ; la mesure de la concentration protéique de l’échantillon est déterminée par comparaison avec cette gamme étalon.

Le dosage par la méthode du biuret est réalisé grâce au réactif de Gornall, qui contient :
-du sulfate de cuivre : source d’ions Cu²⁺ ;
-de l’hydroxyde de sodium NaOH permettant l'alcalinisation du milieu ;
-de l’iodure de potassium qui évite la réduction (gain d’électron) du cuivre en Cu⁺ ;
-du tartrate de sodium ou de potassium qui forme avec les ions Cu²⁺ un complexe, ce qui empêche leur précipitation sous forme de dihydroxyde de cuivre Cu(OH)₂ à pH alcalin.

L’échantillon à doser est incubé en présence du réactif de Gornall pendant 30 minutes à température ambiante et à l’obscurité. L’absorbance à 540 nm est alors déterminée à l’aide de cuves spectrophotométriques en plastique.

Mise en œuvre expérimentale

Réactifs 

• Solution de réactif de Gornall présenté en distributeur automatique.
• Solution étalon de protéine (ovalbumine) notée OVA : ρ_{(Ovalbumine ; sol. étalon)} = 10 g·L^-1.
• Boisson protéinée à doser prédiluée au 1/20^ème notée BP20.
• Diluant (eau distillée).

Réalisation du spectre d'absorption du complexe [Cu²⁺ - liaison peptidique] :
-Introduire 2 mL de solution OVA et 4 mL de réactif de Gornall dans un tube à essai.
-Parafilmer. Bien homogénéiser pour obtenir une solution homogène.
-Attendre 30 minutes à l'obscurité.
-Ajuster à zéro contre de l'eau distillée.
-Mesurer l'absorbance entre 400 nm et 800 nm par pas de 10 nm.

Spectre d'absorption du complexe protéine-Cu²⁺ (courbe 2)
Spectre d'absorption du Gornall seul (courbe 1)

Réalisation de la gamme d’étalonnage et des dosages essais

-Dans une série de 8 tubes à essais, introduire respectivement :

-Parafilmer. Bien homogénéiser.
-Attendre 30 minutes à l'obscurité
-Transférer en cuve de mesure avec une pipette compte-gouttes. Parafilmer.
-Mesurer les absorbances de chaque solution à 540 nm contre le blanc réactif.
-Relever les valeurs mesurées.

Limites de la méthode

• Il faut au minimum 3 ou 4 liaisons peptidiques pour que le complexe protéine-Cu²⁺ donne une coloration détectable.
• La réaction est peu sensible (la concentration en protéine doit être suffisamment élevée)
• La loi de Beer-Lambert est respectée pour ρ _{(protéine ; solution)}  < 10 g·L^-1.
• En milieu alcalin, certains composés chimiques comme les glucides réducteurs sont capables de réduire les ions cuivriques en ions cuivreux.
  Cette méthode ne permet donc par de doser les protéines dans des échantillons complexes tels que le lait.

Indication de mesures relevées au spectrophotomètre

Source : Freepik

Justifier la concentration en protéines dans le tube 1 de la gamme (tableau ci-dessous) en citant la loi mise en œuvre et en rédigeant l'équation aux grandeurs, l'équation aux unités et l'équation aux valeurs numériques.

Reproduire et compléter le tableau de gamme s dans le logiciel tableur-grapheur.

Tracer le nuage de points : A_{540 nm} = f(concentration en masse de protéines en g·L^-1).
Insérer sur le graphe :
- la droite de régression linéaire,
- le coefficient de détermination R²
- l’équation de la droite.

Valider la linéarité de la gamme d’étalonnage.
Donnée :
on considère que la droite d'étalonnage est acceptable si R² > 0,995.
Dans le cas contraire, repérer et supprimer le(s) point(s) aberrants).À l’aide des paramètres de la droite, calculer la concentration en masse de protéines dans la solution protéine diluée au 1/20 BP1/20 pour chacun des deux essais E1 et E2.
- la droite d’étalonnage est de type : y = a.x + b
- on connait la valeur « y » de l’essai : l’absorbance.
- « a » désigne le coefficient directeur,
- « b » désigne l’ordonnée à l’origine

Vérifier à l'aide de l'aide-mémoire de métrologie la compatibilité[1] des deux valeurs mesurées de concentration en protéines.
Donnée : écart-type de reproductibilité s_{r concentration en protéine} = 0,6 g·L^-1

En déduire la concentration en protéines dans la boisson protéinée non diluée.

Calculer l’intervalle d’acceptabilité : la boisson protéinée sera supposée conforme si l’écart entre la valeur trouvée et la valeur présente sur l’étiquette est inférieure à 10 %
Donnée : la concentration théorique est de 130 g de protéines par litre.

Comparer la valeur retenue avec les données du fournisseur et indiquer si la valeur mesurée est conforme à la valeur fournie par le fabricant.