Les bio-insecticides sont des moyens de lutte biologique. Ce sont des insecticides préparés à partir d’organismes vivants ou de leurs produits.

Objectifs :

• aborder l'étude de bactéries caapables de former une structure particulière (l'endospore) en effectuant une comparaison avec une souche de référence non sporulante Gram (négative).
• caractériser et d’identifier la bactérie utilisée comme insecticide biologique. 

Orientation et identification (effectué en partie sous forme d'exercice permettant de réviser les notions des AT précédentes)

Voici les observations microscopiques d'un élève : cellules en forme de bâtonnet de 4 à 6 µm de long et environ 1, 5 de large,  avec une zone blanche sphérique au centre de la cellule qui conserve sa forme de bâtonnet, se déplaçant selon un mouvement lent, sinueux, désordonné.

interpréter ces observations

compléter la description à l'aide du document

Un isolement a été effectué à partir de la suspension du micro-organisme à identifier, incubé 36 h à 37 °C sur gélose TSA en grande boite de Pétri :

Microcinématographie montrant la croissance d'une colonie sur milieu gélosé 

(Crédit : https://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tamop412A/2011-0073_practical_microbiology/ch11s03.html)

Indiquer le rôle de chacun des constituants de la gélose TSA (document 1)

En déduire si la gélose trypticase soja est :
-un milieu d’orientation ou non. Justifier la réponse
-un milieu synthétique ou empirique. Justifier la réponse.

Interpréter le résultat de l'isolement

Un test enzymatique de discrimination rapide est réalisé : une colonie est prélevée est dissociée dans une goutte d'eau oxygénée (H₂0₂) préalablement déposée sur une lame.
Le résultat est le suivant :

Citer le nom du test mis en œuvre.

Justifier le choix de la réalisation de ce test.

Interpréter le résultat du test (photo).

Conclure.

Un milieu Viande-Foie a été ensemencé et incubé 24 h à 37 °C :

indiquer le rôle de ce milieu.

Interpréter le résultat.

Conclure.

Un bouillon hypersalé (7% (m/V) de NaCl ) a été ensemencé et incubé 24 h à 37 °C.
Le milieu est devenu trouble.

Interpréter ce résultat.

Une gélose à l'amidon a été ensemencée et du lugol (eau iodée) ajouté après culture.
Le résultat suivant est le suivant :

À l'aide du document 3 :

Interpréter le résultat.

Conclure.

Utiliser les résultats obtenus et le document 4 pour orienter l’identification de la bactérie par raisonnement dichotomique, en argumentant la réponse.

Utiliser les résultats obtenus et le document 5 pour identifier la bactérie par raisonnement dichotomique, en argumentant la réponse.

Afin de valider la capacité à réaliser une coloration de Gram correcte, deux frottis seront réalisés sur une seule et même lame (avec séparation nette des deux frottis évidemment) : ceci garantit que la coloration sera strictement la même pour chaque type de cellule

• Souche de référence : bactérie à Gram négatif  :

• La bactérie utilisée comme bio-insecticide après coloration des spores au vert de Malachite a froid (solution à 110 g · L^-1) (Gt = 1 000 fois)

Etude réalisée dans le cadre d'un PTA : mise en évidence des cristaux de la toxine protéique de cette bactérie:

DOCUMENT 1

Gélose Trypticase-Soja-Agar (TSA) - Extraits de la fiche Biomérieux ®

La gélose Trypcase Soja est un milieu d’isolement destiné au développement des germes qui ne présentent pas d’exigences particulières pour leur développement.

COMPOSITION  (Formule théorique pour 1 L, pH final 7,3)

Peptone de caséine (bovin) ...............................................................15 g

Peptone de soja....................................................................................5 g

Chlorure de sodium.............................................................................5 g

Agar .............................................................................................. .....15 g

DOCUMENT 2 

L'endospore bactérienne

L'endospore est une structure facultative, qui se forme à l’intérieur de certaines bactéries à Gram

positif (genres  Bacillus,  Clostridium et  Plectridium)  lorsque  les  conditions  de  vie  sont  défavorables.

L’aspect de la spore incluse dans le bacille (endospore) aide à identifier l’espèce.
On notera les caractéristiques suivantes : forme, position, déformation du corps végétatif

DOCUMENT 3 

Gélose à l'amidon - Recherche de l’hydrolyse de l’amidon

INTRODUCTION ET OBJET DU TEST

Les bactéries qui produisent une amylase sont capables d’hydrolyser l’amidon (incorporé à raison de 1% (m/V) dans une base de gélose nutritive ordinaire) :

amidon === amylase ===> maltose 

TECHNIQUE & LECTURE

Ensemencer par une strie longitudinale à la surface du milieu. Incuber à la température désirée.
Quand la culture est suffisante, la mise en évidence de l’hydrolyse  de l’amidon se fait en recouvrant toute la gélose de lugol (eau iodée).
-  l’amidon donne une coloration bleu-violette, indiquant qu’il n’a pas été hydrolysé è amylase (-)
-  un halo clair autour de la culture indique une hydrolyse de l’amidon è amylase (+)

DOCUMENT 4

Caractères d'orientation des bacilles à Gram (+)

DOCUMENT 5 

Caractères pour l'identification de quelques Bacillus

AS : aérobie strict     AA : aéro-anaérobie

[1] Une croissance dans ce milieu indique un caractère halotolérant

Etude de la thermorésistance des spores de la bactérie à identifier

Avec cette réalisation, tous les groupes de travaillent partent du même matériau : la suspension d'opacité équivalente à un étalon Mc Farland.

Résultats : bien que quelques contaminants soient présents, il est possible de dénombrer, sur la plupart des boites, le nombres de colonies.

Pour l'inoculum non chauffé : les colonies sont dues à la présence des formes végétatives

Pour l'inoculum chauffé : les colonies sont dues aux spores qui ont été activées par le choc thermique, les formes végétatives ayant été détruites par la chaleur

En savoir plus : http://www.gerbeaud.com/jardin/decouverte/bacillus-thuringiensis.php