Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudiée.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

L’orientation d'un micro-organisme est la première étape vers son identification : cela consiste à déterminer la famille et/ou le genre auquel il appartient.
Cette orientation se fait par recherche de caractères culturaux et biochimiques du métabolisme respiratoire, glucidique et protéique.

1^ère partie : les grandes étapes de la démarche d'orientation / identification

1. Observation de la culture de départ : mise en évidence des caractères culturaux (exigeant ou non-exigeant, mésophile, thermophile...) et étude morphologique macroscopique des colonies.
2. Étude microscopique (état frais, coloration de Gram => morphologie, mode de groupement, mobilité, Gram).
3. Réalisation des tests enzymatique d’orientation rapides (oxydase ou catalase).
4. Détermination d’un genre ou d’un groupe de genres (par orientation dichotomique).
5. Choix d’une galerie d’identification adaptée (selon l'orientation) et ensemencement de la galerie => observation et interprétation des résultats de chaque milieu après vérification de la pureté de la suspension qui a servi à ensemencer la galerie.
6. Raisonnement dichotomique (oui ou non) ou probabiliste (chiffres de la galerie API) : voir en fin de page/

2^ème partie : les critères de classification

3^ème partie : la taxonomie

Pour comprendre la notion d’identification, il faut se référer à l’arbre phylogénétique (arbre du vivant) et aux définitions suivantes :

• Classification : c’est l’arrangement des organismes en groupes ou taxons selon leur similitude ou leur parenté évolutive.
  Elle a pour but l’attribution d’une identité à un être vivant.
• Taxon : groupe d'organismes vivants qui descendent d'un même ancêtre et qui ont certains caractères communs.
  Les embranchements, classes, ordres, familles, espèces...sont des taxons.
  Exemple de rangs taxonomiques et de noms :

• Identification : cela consiste à placer un individu particulier dans un taxon connu.
  La souche inconnue est comparée à des espèces déjà décrites (souches-types) et le nom de l’espèce la plus similaire est proposé.

• Souche : c’est une population d’organismes descendant d’un organisme unique ou d’un isolat de culture pure.
  Au sein d’une même espèce les souches peuvent présenter des différences légères entre elles qui pourront être caractérisées sur la base :
  • de leurs propriétés biochimiques ou physiologiques pour les biovars ;
  • de leurs propriétés antigéniques pour les sérovars ;
  • de leur facteur de virulence pour les pathovars.

4^ème partie : plan d'étude de la procédure opératoire d'orientation

A partir des indications apportées dans le support d'activité (fiches techniques, chronologie des opérations), un plan d'étude est réalisé afin 

- de bien visualiser l'ensemble des instruments et milieux à mettre en place sur la paillasse
- de ne pas perdre de temps 
 

5^ème partie : lecture des tests effectués

1. Observations microscopiques

Résultats obtenus :
- souche 1 : observation de bâtonnets roses, se déplaçant rapidement.
- souche 2 : observation de bactéries polymorphes, certaines sous forme de bâtonnets très courts, d'autres presques ovalaires, roses avec coloration bipolaire, se déplaçant lentement de façon sinueuse.

• Interpréter les observations faites pour chacun des souches testées

2. Lecture de l'isolement réalisé sur GNO (ou GTS pour Gélose Trpypticase Soja soit TSA pour Trypticase Soy agar en anglais) milieu non sélectif sur lequel l'isolement est réalisé en dernier en jour 1)

Conditions d'incubation : 36 h, 37 °C

• L'isoelement a-t-il été correctement réalisé ?
  Rappel : isoler consiste à séparer les micro-organismes à la surface d’un milieu nutritif gélifié, de manière à ce que, après culture, on obtienne des colonies bien distinctes
• L'isolement permet-il de valider la pureté de la suspension préparée en jour 1 ? Observer minutieusement...
  Rappels :
  - si oui, la galerie d'orientation est validée et interprétable
  - si non, les résultats de la galerie ne sont pas interprétables (et donnés sous réserver, le temps de refaire la manipulation)
• Quelles caractères culturaux peut-on indiquer ?
  Rappel : vérifier le milieux de culture utilisé et la température d'incubation

3. Réalisation du test de discrimination rapide

Seul le test de la recherche de l'oxydase est réalisé. 

• Justifier ce choix au vu des caractères déjà recueillis.

Résultats obtenus :

• Indiquer, pour chaque souche testée, sous forme de tableau : observation / interprétation / conclusion.

4. Lecture des milieux Viande-Foie, Hugh & Leifson et bouillon nitraté

Rappels :
- le milieu VF permet d'étudier le type respiratoire, c'est à dire les relations du micro-organismes vis à vis du dioxygène (métabolisme respiratoire)
- le milieu Hugh & Leifson permet détudier la voie d'attaque du glucose (métabolisme énergétique glucidique)
- le bouillon nitraté permet la recherche des enzymes Nitrate Réductases (1 ou 2)

Résultats obtenus : 

Important : lecture du bouillon nitraté :
- souche 1 : l'aspect observé esr celui obtenu après ajout des réactif NIT 1 et NIT 2
- souche 2 : aspectu observé esr celui obtenu près ajout des réactif NIT 1 et NIT 2 puis poudre de zinc (en excès ici...)

• Indiquer, pour chaque souche testée et pour chaqque milieu, sous forme de tableau : observation / interprétation / conclusion.

6^ème partie : orientation de chacun des souches

• résumer chaque caractère obtenu pour chacune des souches :
  Souche 1 : bacille à cilitaure polaire, Gram (-), oxydase (+), non exigeant, mésophile, aérobie strict, inerte vis à vis du glucose, nitrate réductase (+) stade diazote
  Souche 2 : coccobacilles à ciliature péritriche, Gram (-), oxydase (-), non exigeant, mésophile, aéro-aérobie, fermentatif vis à vis du glucose, nitrate réductase (+) stade nitrites

L'orientation se fait par raisonnement dichotomique : 

• pour chaque souche, procéder de la façon suivante :
  - numéroter de (1) à (9) les genres / familles proposés dans le tableau:
  (1) genre Acinetobacter
  (2) genre Alcaligenes
  (3) etc...
  -Prendre le premier caractère "forme" et le comparer à celui obtenu pour la souche testée:
       - souche 1 : bacille
       - indiquer les genres/familles exclus car ne sont pas des bacilles => (1) car coccobacilles,  (6), (7), (8) et (9) car coques
       - indiquer les genres/familles conservés car sont des bacilles => (2), (3), (4) et (5)
  - Prendre le second caractère et le comparer à celui obtenu pour la souche testée:
       - souche 1 : Gram (-)
       - indiquer les genres/familles exclus (parmi ceux restants après le premier caractère étudié) car ne sont pas Gram(-) => aucun n'est éliminé
       - indiquer les genres/familles conservés car sont Gram (-) => (2), (3), (4) et (5)
  - Continuer ainsi pour chacun des caratères testés 
  - Lorsque tous les caracères de la souche 1 sont épuisés,  on arrive sur un seul genre posibble.
  - Terminer l'orientation en vérifiant que tous les caractères sont bien concordants avec le genre/famille trouvé

• Procéder de la même façon pour la souche 2