Objectif : identifier (analyse qualitative) une biomolécule par une réaction immunologique de type antigène/anticorps de double diffusion en milieu gélosé.

 

Principe et mise en oeuvre (fiche à télécharger)

L’immuno-précipitation (ou précipitation) est un phénomène au cours duquel des antigènes solubles (généralement une protéine ou un polyoside) se combinent avec des anticorps spécifiques pour former un réseau visible sous forme de précipités visibles à l’œil nu.

Une réaction de précipitation est une réaction immunologique en solution aqueuse entre :
-Un antigène (Ag) soluble portant au moins deux épitopes (= partie d'un antigène reconnu par un récepteur situé à la surface d'un lymphocyte)
-Un anticorps (Ac) spécifique dit "précipitant" et possédant au moins deux paratopes (= partie de l'anticorps qui assure la fonction de reconnaissance de l'antigène. Chaque paratope reconnait de façon spécifique l'épitope d'un antigène).

La réaction de précipitation est maximale pour un rapport Ag/Ac précis : le système est alors à l’équivalence, le réseau formé est complet.
La réaction de précipitation peut être inhibée par un excès d’Ac ou d’Ag, le réseau est alors incomplet: c’est le phénomène de zone (source : technique d'immunologie, CRDP édition Aquitaine)

Les réactions de précipitation sont très sensibles à ce phénomène, d’où la nécessité de travailler avec des dilutions différentes de l’Ag ou de l’Ac à étudier.

La vidéo ci-dessous (timelapse réalisée par Karine, notre techicienne, sur une durée totale de 45 minutes) simule la rencontre entre Ag et Ac, diffusant de façon radiale depuis chaque puits,à l'aide de colorants alimentaires :

Proposer une explication justifiant le fait que les puits doivent être équidistants avec une distance de dépassant pas 1 cm.

 l’aide des documents ci-dessus , donner la définition d’un immunoprécipité.

Citer les deux types de molécule intervenant dans cette réaction.

Expliquer le choix du terme « double diffusion » utilisé pour la technique d’Ouchterlony.

Écrire la réaction entre ces deux molécules dans la zone d’équivalence.
Pour cela, schématiser successivement :
a) Un antigène soluble (molécule) portant 4 épitopes.
b) Un anticorps (de type Immunoglobuline G) dont les 2 paratopes sont complémentaires de l’épitope de l’antigène précédemment schématisé.
c) Un réseau antigène-anticorps, à l’aide des deux illustrations précédentes.

Expliquer ce que signifient les affirmations :
a) "Ces réactions d’immunoprécipitation sont très spécifiques"
b) "Ces réactions d’immunoprécipitation sont assez peu sensibles"
c) "Ces réactions d’immunoprécipitation sont soumises à des phénomènes de zone".

Identifier deux points critiques lors de la mise en oeuvre permettant d'obtenir un résultat fiable/lisible.

Proposer un témoin positif et un témoin négatif. Prévoir les résultats attendus pour ces deux témoins et en déduire leur composition.

 

Identification d'un marqueur d'infection virale par immunodiffusion double (méthode d'Ouchterlony)

Le contexte est ici simulé : il s'agit d’effectuer le dépistage du virus de l'hépatite B (VHB) par la recherche d'un antigène de surface (l'antigène HBs) sur quatre sérums, par la technique d’immunodiffusion radiale double.

La réalisation est ici également simulée  :  un artifice de préparation permet d'obtenir (en moins de trente minutes) des arcs de précipitations ressemblant (plus ou moins...) à des arcs de précipitations dus à des immuns-complexes.

Matériel et réactifs

Réactifs	Matériel
- Sérums à tester, numérotés 1 à 4 - Solution pure d'antigène HBs du virus de l'hépatite B	- Une boite de gélose de 55 mm de diamètre - Pipette à piston P100 + cônes adaptés - Emporte-pièce (paille) + système d’aspiration ou cure-dent - Papier filtre

Sécurité
Manipuler et éliminer les réactifs utilisés, ainsi que les matériels à usage unique contaminé en suivant la procédure relative aux produits infectieux ou potentiellement infectieux.

Préparation de la boite 
-Repérer la position des futurs puits par transparence
-Creuser les puits avec un emporte-pièce ; les puits doivent avoir une forme cylindrique parfaite.

Remplissage des puits
-Déposer un volume de 10 µL par puits en veillant à ne pas les endommager.
-Ne pas déplacer ou transporter la boite immédiatement après le remplissage.
-Puits central : 20 µL de solution pure d'Ag HBs
-Puits 1 à 4 : séréumts à tester

Incubation
-Fixer dans le couvercle de la boite de Pétri un papier filtre humidifié (chambre humide)
-Parafilmer la boite (pour limiter la dessication).
-Laisser diffuser à température ambiante pendant 24 h minimum sur une surface plane.

Observation
-Effectuer la lecture sur fond noir et en éclairage rasant

ATTENTION : il s'agit ici d'une simulation assez grossière, la qualité des arcs de précipitation devenant moins fine assez rapidement (photo prise ici un peu tardivement).
Rien à voir avec de vrais arcs de précipitation (mais les solution d'anticorps sontr très onéreuses)
Voir plus bas de vrais arcs de précipitation entre Ag et Ac

Reproduire le résultat sous forme de schéma légendé

Interpréter les résultats obtenus entre le puits central et chacun des puits périphérique.

Indiquer ce que contiennent les sérums S1 à S4 d'après le contenu du puits central.

En déduire ce que signifie la présence des molécules mises en évidence dans les sérums S1 et S4.

Conclure sur l'acceptation ou le rejet de chacun de ces sang par un Centre de Transfusion Sanguine (CTS).

 

Remarque : la photo suivante montre de vrais arcs de précipitation entre un  antigène (albumine) et un anticorps spécifique (anticorps anti-albumine) lors d'une seconde réalisation par les élèves après qu'ils se soient entrainés avec le trucage précédent.
La réaction est très lente : au moins 24 h (souvent 48 h), à température ambiante et en enceinte humide.