Pour rechercher une pathologie, des tests enzymatiques sont fréquemment pratiqués dans les laboratoires d’analyses médicales. La plupart des ces tests sont réalisés sur des prélèvements sanguins.  On peut alors doser soit un substrat, soit une activité enzymatique.

En effet, lors d’une souffrance cellulaire, des enzymes habituellement intracellulaires peuvent se retrouver libres dans le plasma à de fortes concentrations. L’aide au diagnostic est donc souvent facilitée par la connaissance de la provenance de l’enzyme retrouvée en quantité anormale. Le tableau suivant en fournit quelques exemples :

Enzyme	Source
Alanine aminotransférase (ALAT)	foie
Amylase	Glandes salivaires, pancréas
Aspartate aminotransférase (ASAT)	Cœur, muscle squelettique
Créatine kinase (CK)	Muscle, cœur, cerveau
Phosphatase acide (PAC)	Prostate
Phosphatase alcaline (PAL)	Muqueuse intestinale, rein, os

Le tissu malade peut être aussi identifié par la détermination du profil d’isoenzymes.
[D’après l’ouvrage : Enzymologie et applications de Jean-Pierre SINE (édition ellipses 2010)]

 

La détermination de l’activité ALAT plasmatique (ou GPT) d'un patient masculin est réalisée  par le kit « Enzyline ALAT/GPT » de BioMérieux, selon la réaction :

ALAT ou GPT = transaminase glutamique pyruvique

LDH = lactate déshydrogénase

• Indiquer, en justifiant, quelle est : la réaction principale ; la réaction indicatrice ; la réaction intermédiaire (si il y en a une).

Pré-incuber le mélange de réactif (R1+R2) 10 min à 30°C ou 37°C en bain thermostaté

Ajuster le spectrophotomètre à zéro contre de l’air ou de l’eau distillée introduire dans une semi-microcuve spéciale UV : - 1 000 µL du mélange de réactif (R1+R2) préalablement incubé 10 min à 30 ou 37°C - 150 µL d’échantillon de plasma à doser Parafilmer, homogénéiser rapidement, déclencher le chronomètre et introduire dans le spectrophotomètre thermostaté à 30°C ou 37°C. Attendre 1 minute. Mesurer la variation de l’absorbance à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 3 minutes

La méthode mise en oeuvre est une méthode cinétique en continue car on effectue la mesure de l’absorbance sur trois minutes sans arrêter la réaction.
Ici, le substrat doit être en excès ainsi que tous les autres constituants (coenzymes, cofacteurs) à l'exception de l'enzyme à doser, qui doit être limitante.

• Expliquer pourquoi la procédure indique d'attente 1 minute avant de commencer à mesurer l'absorbance.

• Justifier, à l'aide des spectres d'absorption ci-dessous, le choix de la longueur d'onde de 340 nm

• Sécurité : rechercher 
  - un danger éventuel, sa nature et la ou les voies d'exposition
  - puis une situation exposant au danger liée à la réalisation de procédure
  - proposer, si nécessaire la (les) mesure(s) de prévention adaptée(s) (collectives et individuelle) au(x) risque(s) encouru(s)

La cinétique obtenue est la suivante : 

• Démontrer que la pente (coefficient directeur) vaut - 0,0221 min^-1 puis convertir en s^-1.

• Calculer la vitessse initiale de transformation ξi en mol·s^-1 selon l'équation aux grandeurs

ε _{NADH, H+} = 6 220 L·mol^-1·cm^-1

3) Valider l'équation aux grandeurs précédente en rédigeant l'équation aux unités.

4) En déduire l’activité z_{(ALAT ; 150 µL de plasma)}  de l’ALAT en nkat puis en U.
Données :  
- l’activité enzymatique (z) contenue dans le milieu réactionnel porte lamême valeur numérique que la vitesse initiale de transformation ξi (enmole·s^-1) dans le milieu réactionnel et est exprimée en katal.
- 1 U est la quantité d’enzyme nécessaire pour la transformation de 1 µmol de substrat par minute.

Réponse : les calculs et conversions doivent amener aux valeurs suivantes :
z_{(ALAT ; 150 µL de plasma)}  = 6,76·10^-11 katals 
z_{(ALAT ; 150 µL de plasma)}  = 4,05·10^-3 U 

• Déduire  la concentration d’activité catalytique b_{(ALAT ; plasma)} en nkat·L^-1 et en U·L^-1.

• Comparer avec les valeurs usuelles et conclure.

Données : valeurs usuelles dans le sérum à 30 °C :

Hommes : 100-750 nkat·L^-1 ou < à 29 U·L^-1 à 30 °C ou < 40 U·L^-1 à 37 °C

Femmes : 80-580 nkat·L^-1 ou < à 24 U·L^-1 à 30 °C ou < 33U·L^-1 à 37 °C

• Conclusion : utiliser tous les résultats pour indiquer si le patient semble souffrir souffre d’une pathologie.