Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

En médecine, les enzymes sont employées essentiellement :
- comme indicateurs de la concentration (ou activité) d’enzymes dans les fluides biologique (sérum, urine, liquide céphalorachidien…) pour déceler une pathologie ;
- comme réactifs pour l’analyse de composés non enzymatiques (dosage de substrat, molécule biologique, médicament…) ou d’enzymes ;
-comme agents thérapeutiques.

Pour rechercher une pathologie, des tests enzymatiques sont fréquemment pratiqués dans les laboratoires d’analyses médicales. La plupart de ces tests sont réalisés sur des prélèvements sanguins.  On peut alors doser soit un substrat, soit une activité enzymatique.

En effet, lors d’une souffrance cellulaire, des enzymes habituellement intracellulaires peuvent se retrouver libres dans le plasma à de fortes concentrations. L’aide au diagnostic est donc souvent facilitée par la connaissance de la provenance de l’enzyme retrouvée en quantité anormale. Le tableau suivant en fournit quelques exemples :

Tableau 1 : provenance de quelques enzymes utiles au diagnostic médical
 [D’après l’ouvrage : Enzymologie et applications de Jean-Pierre SINE (édition ellipses 2010)]

Caractérisation par bio-informatique de phosphatase alcalines

A venir

Détermination des vitesses de transformation, d'activité enzymatique et de concentration d'activité catalytique (méthode cinétique continue et 2 points)

PRINCIPE
La phosphatase alcaline PAL catalyse des réactions d’hydrolyse du groupement phosphate.
Son activité est étudiée en utilisant un chromogène (substrat incolore, en général le paranitrophénol-phosphate) qui donne un chromophore (produit coloré) après hydrolyse de son groupement phosphate.
Le pH alcalin permet de révéler la coloration du pNP et de créer un milieu favorable à l’activité de la PAL.
La réaction peut être arrêtée par une addition importante de NaOH entraînant une dénaturation irréversible de l’enzyme (ou par Na₂HPO₄, inhibiteur).

MOYENS

• Pipette à piston P1000 + cônes adaptés
• Semi-microcuves spectrophotométriques de 1 mL
• Spectrophotomètres réglés sur 405 nm.
• Petit matériel : poubelles, parafilm, papier filtre …

REACTIFS

• Tampon hydrogénocarbonate pH 9,8
• Solution de substrat pNPP (M = 371 g.mol^-1) à 20 mmol.L^-1 en tampon hydrogénocarbonate pH 9,8
• Plasma de la patiente contenant la PAL dont il faut doser l’activité à conserver dans la glace
• Solution de NaOH (à 2 mol.L^-1) = solution d’arrêt.

A-Méthode cinétique continue

Préparation du poste de travail devant le spectrophotomètre

• Régler la longueur d’onde du spectrophotomètre à 405 nm.
• Préparer deux papiers Parafilm®, un chronographe, une pipette à piston de 10 µL + cônes, une pipette à piston de 1000 µL + cônes

Préparation du blanc réactif :

• Introduire dans une cuve de mesure :
  • 0,5 mL de solution de substrat pNPP 
  • 0,5 mL de tampon hydrogénocarbonate 
• Ajuster le spectrophotomètre à zéro sur cette solution.

Déclenchement de la réaction

• Une fois le spectrophotomètre ajusté à zéro, réaliser le plus rapidement possible les gestes suivants :

• Ajouter 100 µL du plasma contenant l’enzyme dont il faut doser l’activité.
• Parafilmer et homogénéiser immédiatement par retournement avec le Parafilm®.
• Placer la cuve dans le porte-cuve et immédiatement déclencher le chronographe

• Suivre l'évolution de l'absorbance en continu sur cinq minutes :
  • Soit sur l’écran du PC relié au spectrophotomètre (puis exporter la courbe sur clé USB).
  • Soit relever l’absorbance toutes les 30 secondes.

Exemples d'indications d'absorbance relevées toutes les 30 secondes (2021) :

Tracer le nuage de points : A_{à 340 nm contre blanc réactif} = f(temps en secondes).

Titrer et légender.

Cinétique continue avec le sérum S1 fourni

Cinétique continue avec le sérum S1 fourni dilué au 1/2

Délimiter les phases visibles de la réaction enzymatique sur chacun des graphes et déterminer la durée de la période pendant l'apparition du chromophore est proportionnelle au temps.
Calculer le coefficient directeur ΔA/Δt en min^-1 sur la période de proportionnalité d’apparition du substrat.
En déduire l’équation aux unités permettant de calculer la vitesse initiale de transformation ξi.
Etablir l’équation aux valeurs numériques et calculer ξi

Convertir la vitesse initiale de transformation ξi activité enzymatique z_{(enzyme ; volume solution enzymatique testé)} exprimée en katals (kat).
Donnée : le katal est donc la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde.
Cette unité est rarement utilisée car beaucoup trop grand. On général on utilise le µkat (10^-6 katal) ou le nkat (10^-9 katal).
La plupart des biochimistes utilisent l‘unité internationale (UI), qui est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par minute ; 60 UI valent donc 1 µkat.

En déduire l’équation aux unités permettant de calculer la concentration d’activité catalytique b_{(PAL ; sérum)} de la PAL.
Etablir l’équation aux valeurs numériques et calculer la concentration d’activité catalytique b_{(PAL ; sérum)} de la PAL dosée dans les 100 µL de solution d’enzyme testée (plasma), exprimée en kat.mL^-1.

Un dosage des protéines plasmatiques a été effectué et indique 8 mg de protéine par millitre.
En déduire l’équation aux unités permettant de calculer l’activité spécifique z_sp exprimée en kat.mg^-1 dans les 100 µL de plasma testé.
Etablir l’équation aux valeurs numériques et calculer l’activité spécifique z_sp exprimée en kat.mg^-1 dans les 100 µL de plasma testé.

A l’aide des données recueillies, compléter le tableau de procédure de la méthode dite deux points.
Rappel : une vitesse de transformation implique de calculer un coefficient directeur ; celui-ci ne peut se calculer que sur une droite.
 

B-Méthode deux points

Cette méthode de dosage est la plus rapide à mettre en oeuvre puisque 2 mesurages d'absorbance à deux temps déterminés et mesurées exactement suffisent.
Les mesures sont effectué en différant le déclenchement de la réaction entre le tube 1 et le tube 2, et en stoppant la réaction dans chacun des tubes après une durée courte pour le premier tube, plus longue pour le second tube, mais au bout d'un temps qui est impérativement inclus dans la période initiale.
Cela nécessite donc de connaitre au préalable la durée de la période initiale, qui a pu être déterminée au préalable (par méthode cinétique continue ou par points).
L'avantage est la rapidité d'exécution et le faible temps de mobilisation du spectrophotomètre.

Mesurer A₄₀₅ nm des cuves E1 et E2 contre un blanc réactif contenant, dans l’ordre :
- 0,5 mL de NaOH (solution d’arrêt) 
- 0,5 mL de solution de pNPP 
- 0,5 mL de tampon hydrogénocarbonate 
- 100 µL de plasma à tester

Refaire les calculs précédents avec les valeurs obtenues par la méthode deux points.

Exemples d'indications d'absorbance (2021) :

C-Méthode cinétique par points

La méthode cinétique par points consiste à suivre l'évolution d'une réaction enzymatique au cours du temps mais de manière discontinue.
Plutôt que de laisser la cuve contenant le mélange réaction dans le porte-cuve du spectrophotmètre (réglé à la longueur d'onde de travail et préalablement ajusté à zéro sur un blanc réactif adapté), on déclenche la réaction enzymatique dans une série de cuves (en différant chaque départ d'une minute par exemple) puis on laisse la réaction se dérouler pendant unue durée croissante.µ
Une fois la durée voulue écoulée, il faut stopper la réaction en cours dans chaque cuve. Il est donc essentiel de mesurer chaque durée de façon très exacte, à l'aide d'un chronographe.
La réaction est stoppée par, très souvent, l'ajout d'une solution de soude concentrée ; le changement brutal de pH provoque une dénaturation instantanée de l'enzyme, ce qui met fin à la réaction.
L’ensemble des cuves permet donc de réaliser une cinétique car entre chaque cuve, la durée de la réaction enzymatique augmente : on obtient donc la quantité de produit formé entre 0 à 40 minutes, mais de manière discontinue.

Remarques :

• il est possible de déterminer la période initiale, même si des points supplémentaires auraient été bienvenus entre t=0 min et t = 8 minutes. Toutefois, l'inflexion de la courbe montre que la période initiale prend fin au bout de 20 minutes, période à délimiter en traçant la tangente à la partie linéaire de la courbe.
• Si la concentration intiale en substrat n'est pas suffisamment importante ou si la concentration en enzyme active est trop élevée, la durée de la période initiale sera plus courte et donc la détermination de la période initiale risque d'être plous difficile.

Vocabulaire :
- chonomètre : intrument qui mesure l'écoulement du temps (n'importe quelle montre donc)
- chronographe : instrument qui mesure un intervalle de temps (qui est donc l'instrument à utiliser).

A partir de la période initiale, il est possible de calculer :
- le cofficient directeur en min^-1
- la vitesse initiale de transformation ξi (en mol.s^-1)
- la vitesse initiale volumique de transformation vi (en mol.L^-1.s^-1)
- l'activité enzymatique z de l'enzyme testée dans le volume d'enzyme testé (en katals)

Connaissant le volume total de solution d'enzyme présent dans le flacon commercial ainsi que la concentration en masse de protéines dans cette solution (qui pourrait d'ailleurs être vérifiée par un dosage selon une méthode appropriée : biuret, Folin-Lowry, BCA...), on peut calculer :
- la concentration d'activité catalytique b de la PAL dans la solution de PAL (en kat.mL^-1)
- l'activité spécifique z_sp de la PAL (en kat.mg^-1)

Voici des exemples de valeurs calculées au terme de l'activité par la méthode cinétique continue (1er tableau) et la méthode deux points (2ème tableau)

Comparaison des valeurs mesurées pour les deux méthodes mises en oeuvre :
-  que peut-on constater ?
-  est-ce normal ?