Objectifs :
- identifier quelques genres de moisissures (micromycètes) utiles ou nuisibles
- effectuer la recherche d'une mycotoxine par méthide immunologique (méthode d'Ouchterlony de double diffusion en milieu gélosé
- cultiver des moisissures en milieu liquide pour récupérer une molécule d'intérêt thérapeutique (pénicilline)

Exemples d'utilisation des mycètes en biologie

1^ère partie : observation et identification de mycètes d'intérêt biotechnologique

En premier lieu, quelques vidéos présentant les moisissures (plusieurs autres vidéos sont disponibles sur le même site).

Prélévement non destructif par empreinte au scotch

C'est une technique spécifique de l’observation des moisissures. Elle permet de réaliser un prélèvement non destructif à l’aide d’un ruban adhésif utile à l’identification des champignons microscopiques.

-Préparer au préalable une lame (dégraissée) en déposant en son centre une goutte de colorant (bleu de lactophénol)
-Couper un morceau de ruban adhésif (type « Crystal », parfaitement transparent) de 2 cm de long en évitant absolument de laisser ses empreintes sur la face adhésive.
-Utiliser deux pinces pour manipuler le ruban adhésif.
-Appliquer la face adhésive sur la moisissure après avoir très délicatement soulevé le couvercle de la boite de Pétri.
-Poser le morceau de ruban adhésif sur la goutte, face collant sur la lame.
-Déposer une goutte de bleu de lactophénol sur le ruban adhésif et recouvrir d’une lamelle d’une taille suffisamment grande pour recouvrir le ruban adhésif
-Observer successivement aux objectifs  x10 puis x40.

• Les moisissures produisent des quantités très importantes de spores, qui peuvent contaminer rapidement toute une salle. Il est essentiel de limiter au maximum l’ouverture des boites de culture, et si la salle en dispose, de travailler sous un PSM (Poste de Sécurité Microbiologique).
• Objectif x40 (pas d'huile !!!).
• Éclairage faible : condenseur baissé, diaphragme fermé, rhéostat au minimum.

Clichés d'aspects macroscopiques et de microscopie optique de différents genres de moisissures utiles ou nuisibles pour l'homme, réalisés au laboratoire du lycée (la procédure opératoire de prélèvement non destructif de mycélium est disponible dans le document de iches, rubrique téléchargement, ou auprès de votre enseignant de biotechnologie)

Autres photographies d'observations faites au laboratoire :

Hyphe septé :

Dessin d'observation réalisé par une élève de 1ère au talent certain !

Timelapse montrant la croissance d'hyphes (acquisition : microscope USB à 15 euros + logiciel Avacam)

Test du microscope USB à 15 euros :

• Indiquer en quoi consiste : un examen macroscopique des moisissures ; un examen microscopique des moisissures.

2^ème partie : étude de milieux de culture pour moisissures et levures

• Repérer et donner le rôle des constituants nutritifs de chaque milieu.

• Expliquer pourquoi ces milieux ont souvent un pH compris entre 5,6 et 6

• En se basant sur le texte suivant, réfléchir aux risques liés à la manipulation.

3^ème partie : repiquage de moisissures et comparaison de la vitesse de croissance par mesure des diamètres des thalles au cours du temps

Aspect à J+3

4^ème partie : culture de moisissures en milieu liquide dans le but de récupérer une molécule d'intérêt thérapeutique (pénicilline)

Culture de moisissure Penicillium chrysogenum en milieu Sabouraud liquide, sous agitation douce.
On remarque que, contrairement aux bactéries qui se développent en milieu liquide sans former de colonies mauis en rendant trouble le milieu, les moisissures forment des structures sphériques (du fait de leur croissance centrifuge à partir d'une spore) et que le milieu reste parfaitement limpide (un trouble du milieu traduisant alors une contamination microbienne)

5^ème partie : recherche d'une mycotoxine (la patuline) par méthode immulogique (double diffusion) dans un produit fermenté

Certaines espèces de moisissures (appartenant aux genres (Aspergillus, Fusarium, Stachybotrys, Penicillium…) sécrètent des mycotoxines. Plus de 300 d'entre elles ont été identifiées, mais seule une trentaine possède des propriétés toxiques réellement préoccupantes pour l'homme ou l'animal.

La méthode d'Ouchterlony permet de détecter (mettre en évidence = analyse qualitative) un antigène (ou un anticorps) par la formation d'un immuncomplexe à l'aide d'un anticorps (ou d'un antigène) spécifique, se traduisant par la formation d'un réseau visualisé sous forme de précipité visible à l'œil nu.

Réactifs :        
-Solutions à analyser contenant l'antigène à rechercher (50 µL de chaque)
-Solution contenant l'anticorps spécifique de l'antigène recherché (50 µL)       

Remarque :  cela peut être l'inversé : plusieurs solutions contenant un anticorps à rechercher et une solutions contenant l'antigène spécifique de l'anticorps recherché

Matériel :
-Une boite de gélose chimiquement inerte (agar à 1,5 % m/V) de 55 mm de diamètre
-Pipette à piston P100 + cônes adaptés
-Emporte-pièce
-Papier filtre pour réaliser la chambre humide

Sécurité
Manipuler et éliminer les réactifs utilisés, ainsi que les matériels à usage unique contaminé en suivant la procédure relative aux produits infectieux ou potentiellement infectieux.

Préparation de la boite
-Placer la boite au-dessus du gabarit fourni
-Repérer la position des futurs puits par transparence
-Creuser les puits avec un emporte-pièce ; les puits doivent avoir une forme cylindrique parfaite

Remplissage des puits
-Déposer un volume de 10 µL par puits en veillant à ne pas les endommager
-Ne pas déplacer ou transporter la boite immédiatement après le remplissage.

Incubation
Fixer dans le couvercle de la boite de Pétri un papier filtre humidifié (è chambre humide)
Parafilmer la boite.
Laisser diffuser à température ambiante pendant 24 h minimum sur une surface plane.

Observation
-Effectuer la lecture sur fond noir et en éclairage rasant. Un immuncomplexe apparait sous la forme d'un arc blanchâtre de précipitation.

- Réservoir central : solution d'anticorps anti-patuline
- réservoirs périphériques :     

I : échantillon contenant de la patuline
II : échantillon ne contenant pas de patuline
III et IV : échantillons de cidres à tester

Rédiger un schéma légendé présentant les résultats obtenus.

• Indiquer quels sont les deux témoins et leurs rôles. Valider les témoins.
• Interpréter les résultats obtenus pour les deux échantillons testés.

• Conclure.

Résumé :