Objectif :  vérifier la présence ou l’absence d’un gène de résistance codant une enzyme dégradant les antibitioques de la famille des bêta-lactamines dans deux plasmides bactériens par une technique d’amplification d’acide nucléique : la PCR (Polymerase Chaine Reaction) aussi nommée ACP en français (Amplification en Chaine par Polymérisation).

Un plasmide est une molécule d’ADN circulaire double brin que l’on retrouve chez les bactéries et les levures. Cette molécule d’ADN facultative est distincte de l’ADN chromosomique et capable de réplication autonome. Présents en nombre variable dans les cellules, les plasmides sont porteurs d’informations génétiques ; ainsi, ils participent aux transferts horizontaux de gènes entre différentes populations et espèces microbiennes.

Paires d’amorces	Amorce 1	Amorce 2
A	5' - CTC CCC GTC GTG TAG ATA - 3'	5‘- AAG TCG TAG AAA ATG AAA - 3’
B	5’ - GAG GGG CAG CAC ATC TAT - 3'	5’ - TTC AGC ATC TTT TAC TTT - 3'
C	5’ – TTT CAT TTT CTA CGA CTT - 3'	5’ - GAG GGG CAG CAC ATC TAT - 3'
D	5’ – AAA GTA AAA GAT GCT GAA – 3’	5‘- CTC CCC GTC GTG TAG ATA – 3‘

Rechercher la taille de l’amplicon attendu en cas de présence du gène bla.

Reproduire et compléter le tableau de manipulation proposé dans le document 3 : repérer le volume final contenu puis calculer le volume de Master Mix 2X à ajouter (concentration finale attendue = 1X)

Indiquer la composition qualitative et quantitative : du témoin négatif de PCR pour chacun des deux plasmides et d’un témoin positif de PCR pour le gène recherché.

Prévoir les résultats à l’issue des manipulations en schématisant le gel d’électrophorèse obtenu. Pour cela, considérer que les solutions suivantes sont déposées dans les puits du gel d’agarose :

• puits 1 : marqueur de taille constitué d’un mélange d’ADN linéaire :
  5 000, 3 000, 2 000, 1 500, 1 000, 750, 500, 300 et 100 pb (E Les chiffres en gras correspondent à des marqueurs apparaissant de façon plus intense sur le gel, facilitant la lecture de l’échelle).
• puits 2 : solution d’amplification obtenue à partir du plasmide porteur du gène bla ;
• puits 3 : solution d’amplification obtenue à partir du plasmide non porteur du gène bla ;

Calculer la masse d’agarose à peser pour préparer 100 mL de gel à 1,2 % (m/V).

 

T1. Amplification de l’ADN

• Réaliser l’amplification correspondant à chaque ADN plasmidique selon le tableau de procédure opératoire fourni dans le document 3.
• Réaliser un témoin négatif pour l’ensemble du groupe pour chaque plasmide.
• Réaliser un témoin positif de PCR du gène recherché
• Programme le thermocycleur suivant les indications fournies dans le document 4
• Placer les microtubes dans le thermocycleur et lancer la PCR.
• En fin de PCR, conserver les échantillons dans la glace jusqu’au moment de l’électrophorèse.

T2. Analyse par électrophorèse des produits d’amplification

• Séparer les amplicons sur gel d'agarose à 1,2 % (m/V) en suivant la procédure présentée dans le document 5.
• Scanner le gel (révélation sous lumière UV).

Plan de dépôt sur le gel n°1 (10 puits) : plasmide P1, témoins, marqueur de taille

Manip.	PCR P1	PCR P1	PCR P1	T(-) P1	MT	T(+) bla	PCR P1	PCR P1	PCR P1
Poste

Plan de dépôt sur le gel n°2 (10 puits) : plasmide P2, témoins, marqueur de taille

anip.	PCR P2	PCR P2	PCR P2	T(-) P2	MT	T(+) bla	PCR P1	PCR P1	PCR P1
Poste

 

Résultats obtenus à analyser

 

Annoter l’électrophorégramme en indiquant :
-un titre adapté ;
-les bornes (cathode, anode et leurs polarités respectives)
-le sens de migration des acides nucléiques ;
-la composition du contenu des puits ;
-les conditions de migration (nature et pH du tampon, voltage, durée, révélateur.

Décrire les observations des différentes amplifications sous forme d’un tableau précisant pour chaque piste :
- le nombre de bandes obtenues ;
- leur position par rapport au marqueur de taille.

Analyser le témoin négatif et le témoin positif.
Valider (ou non) l’interprétation des PCR mises en oeuvre .

Comparer les résultats obtenus pour les deux ADN plasmidiques testés.

Comparer les pistes contenant les ADN plasmidiques.

Les applications de la PCR (source : Biorigami)

– PCR de détection (diagnostic ?) : celle qui vous permet de croire que vous avez dans votre extraction l’agent infectieux que vous tâchez de cibler

– PCR de monitoring : celle qui vous suffit pour admettre que vous validez ou non l’expérience que vous désirez suivre, celle qui vous  dit que vous avez contaminé votre extraction d’ARN en ADN génomique, par exemple

– PCR de production : celle qui vous permet d’obtenir le plus de produit spécifique afin d’exploiter ces quelques centaines de paires de bases pour en faire ce que vous avez imaginé (reporters à spotter sur puce ADN ou insert pour un clonage)

– PCR quantitative : celle qui se résume à estimer du mieux possible la quantité d’acides nucléiques ciblés présents initialement dans une PCR (cDNA, cible pathogène…).