Simuler une double restriction d'un ADN circulaire

Comment comprendre facilement le résultat d'une double restriction d'un plasmide par deux enzymes de restriction différentes ? 

Simplement avec une feuille, du papier, un ciseau 

1) Découper une bande de papier, scotcher les deux extrémités et recopier les sites de restriction (ici XbaI et ApaI), séparés ici par une courte séquence correspondant au site multiple de clonage,  en indiquant l'orientation de chaque brin, puis la façon dont l'enzyme va couper la séquence cible (en rouge)

Simulation double restriction 1

 

2) Sur le plasmide circulaire, en suivant le sens des aiguilles d'une montre, reproduire le premier gène rencontré (gène de résistance à l'antibiotique)

Simulation double restriction 2

 

3) Poursuivre dans le sens des aiguilles d'une montre sur le schéma : on tombe sur l'origine de réplication

Simulation double restriction 3

Remarque : cette photo montre ces étapes mais sans avoir circularisé le plasmide

Simulation double restriction 4

 

4) Avec une paire de ciseau, couper le plasmide circulaire au niveau d'un premier site de restriction

Simulation double restriction 5

 

5) Couper ensuite au niveau du second site de restriction.

On obtient donc deux fragments :
- Ce qui reste du site multiple de clonage (sans intérêt
- Le plasmide linéarisé possédant deux extrémités cohésives (collantes) différentes (en profiter pour compléter les extrémités obtenues), permettant un remodelage moléculaire avec un fragment exogène lui-même digéré par les deux mêmes enzymes

Simulation double restriction 6

 

1/ Les extrémités obtenues pour le site de restriction XbA I sont :

2/ Les extrémités obtenues pour le site de restriction ApaI sont :

3/ Le MCS désigne :

4/ La bactérie intégrant ce plasmide recircularisé après insertion d'un fragment d'ADN exogène

5/ Ori désigne

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