Comment comprendre facilement le résultat d'une double restriction d'un plasmide par deux enzymes de restriction différentes ?
Simplement avec une feuille, du papier, un ciseau
1) Découper une bande de papier, scotcher les deux extrémités et recopier les sites de restriction (ici XbaI et ApaI), séparés ici par une courte séquence correspondant au site multiple de clonage, en indiquant l'orientation de chaque brin, puis la façon dont l'enzyme va couper la séquence cible (en rouge)
2) Sur le plasmide circulaire, en suivant le sens des aiguilles d'une montre, reproduire le premier gène rencontré (gène de résistance à l'antibiotique)
3) Poursuivre dans le sens des aiguilles d'une montre sur le schéma : on tombe sur l'origine de réplication
Remarque : cette photo montre ces étapes mais sans avoir circularisé le plasmide
4) Avec une paire de ciseau, couper le plasmide circulaire au niveau d'un premier site de restriction
5) Couper ensuite au niveau du second site de restriction.
On obtient donc deux fragments :
- Ce qui reste du site multiple de clonage (sans intérêt
- Le plasmide linéarisé possédant deux extrémités cohésives (collantes) différentes (en profiter pour compléter les extrémités obtenues), permettant un remodelage moléculaire avec un fragment exogène lui-même digéré par les deux mêmes enzymes