Analyse microbiologique des eaux : coliformes, streptocoque fécaux, flore aérobie mésophile totale, spores de Clostridium perfringens

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Les eaux destinées à l'alimentation humaine (mais aussi celles qui sont destinées à l'alimentation animale, à l'arrosage des légumes et des fruits, à la baignade, …)  doivent être exemptes de tout organisme pathogène ou opportuniste susceptible de provoquer des troubles de la santé chez ceux qui les consommeraient ou les utiliseraient

 L’objectif est de rechercher des germes témoins de contamination fécale :

  • germes aérobies revivifiables à 22 °C et à 37 °C (également appelé flore aérobie mésophile totale : FAMT)
  • coliformes (totaux, thermotolérants (=fécaux) et Escherichia coli)
  • entérocoques (streptocoques fécaux)
  • spores de Clostridium sulfitoréducteurs (témoin peu spécifique de contamination fécale ancienne car certains sont saprophytes du sol) ou de Clostridium perfringens (témoin plus spécifique de contamination fécale ancienne)

en savoir plus : http://www.ecosociosystemes.fr/controle_qualite.html

 

1ère partie : dénombrement des germes aérobies revivifiables à 22 °C et 37 °C (FAMT) par ensemencement dans la masse

Le dénombrement est réalisé après dilutions en série de raison 1/10, sous un volume final de 10 mL (diluant = eau physiologique stérile) par la méthode d'ensemencement dans la masse d'un milieu gélosé (gélose Plate Count Agar PCR) avec coulage d'une surcouche de gélose blanche.

Effectuer le dénombrement de la FAMT (méthode d'ensememencement dans la masse, Vinoculum = 1 mL, milieu PCA) sur cette série de dilutions : d100, d10-1, d10-2 :

Denombrement a realiser 2

  1. Commenter la qualité de la réalisation
  2. Indiquer quelles sont les colonies à dénombrer.
  3. Analyser la cohérence inter-dilution :
    - le rapport du nombre de colonies entre deux dilutions est-il cohérent avec le facteur de dilution ?
    - la norme ISO 7218 (ci-dessous) peut-elle être applquée ?
  4. Indiquer, selon les consignes de la norme, les deux dilutions retenues.
  5. Exprimer le résultat du dénombrement en UFC de micro-organismes mésophiles.mL-1 d’eau de piscine.

Remarque : le comptage sur ordinateur peut-être réalisé avec le logiciel MESURIM PRO. Exemple :

Denombrement levures

 

Dénombrement selon la norme ISO 7218 (octobre 2007)

Cette norme officialise l’utilisation d’une seule boite par dilution. En microbiologie alimentaire, il est pertinent d'appliquer la formule de calcul probabiliste conseillée par l'association française de normalisation (AFNOR). Le calcul du nombre d’UFC par mL (ou par g de produit) consiste à faire la moyenne pondérée du nombre de colonies obtenues sur deux dilutions successives (calcul valable lorsque le rapport du nombre de colonies entre les deux dilutions est cohérent avec le facteur de dilution).
Choisir deux dilutions successives dont :

  • L’une au moins présente un minimum de 10 colonies ;
  • Le nombre maximal de colonies en totalité est de 300 par boite (remarque : on limitera à 150 colonies pour un milieu contenant un indicateur coloré de pH et/ou permettant de lire un caractère biochimique)

Équation aux grandeurs :  cN(micro-organisme ; suspension) = Ʃc / (V x 1,1 d)

avec :

-cN(micro-organismes ; suspension) = concentration en nombre d’UFC par millilitres (ou grammes)

- Ʃc = somme des colonies comptés sur les deux boites retenues

- V = volume de l’inoculum appliqué à chaque boite, en millilitre

- d = première dilution exploitable (par exemple, si on retient les boites de dilutions 10-1 et 10-2 exploitables, d=10-1 est la première dilution exploitable).

Le résultat est arrondi à 2 chiffres, exprimés avec un nombre compris entre 1,0, et 9,9 multiplié par la puissance de 10 appropriée.

 

 

2ème partie : dénombrement des coliformes totaux et thermotolérants (fécaux) en milieu liquide (méthode probabiliste du NPP)

Les manipulations ont été réparties de façon à dénombrer :

  • les coliformes totaux : entérobactéries (bacilles à Gram négatif, oxydase (-), aéro-anaérobie, fermentatives du glucose, peu exigeantes, nitrate réductase (+)) lactose (+) et gaz (+) à 30 °C
  • les coliformes fécaux (ou thermotolérants) : entérobactéries (bacilles à Gram négatif, oxydase (-), aéro-anaérobie, fermentatives du glucose, peu exigeantes, nitrate réductase (+)) lactose (+) et gaz (+) à 44 °C

Effectuer le dénombrement des coliformes thermotolérants (dits fécaux) sur cette série de dilutions (2 tubes par dilution) : d10-1, d10-2, d10-3, d10-4, d10-5

(méthode du nombre le plus probable ; Vinoculum = 1 mL ; milieu = Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant BLBVB)

Coliformes sur blbvb 2

  1. Effectuer la lecture des milieux BLBVB + cloche (résultats sous forme de tableau).
  2. En utilisant la méthode probabiliste dite du Nombre le Plus Probable (NPP), évaluer le nombre de coliformes fécaux par mL d’eau de piscine.

 

3ème partie : dénombrement des spores de CLostridium sulfito-rédcucteurs et de Clostridium perfringens

La recherche des spores :

  • par chauffage préalable de l'eau à 90 °C pendant 10 minutes
  • suivie de l'inoculation de 20 mL dans 4 milieux VFSR (5 mL par milieu) régénérés en gros tubes profonds
  • suivie d'une incubation à 37 °C (dénombrement des spores issues de Clostridium sulfitoréducteurs) et à 44 °C (dénombrement des spores de Clostridium perfringens)

s'est révélée négative.

Aussi, un second dénombrement a été mis en oeuvre : celui des formes végétatives.

Voici le résultat obtenu après 24 h d'incubation à 37 °C :

Anaerobies sulfuto reducteurs a 37 c

  1. Effectuer la lecture des milieux : justifier l'aspect des colonies.
  2. Indiquer quelle(s) bactérie(s) sont recherchées au vu des conditions opératoires.
  3. Réaliser le dénombrement des formes végétative et rendre le résultat en UFC. 100 mL-1 d'eau de piscine

 

4ème partie : dénombrement des entérocoques fécaux par filtration sur membrane 

Procédure opératoire mise en oeuvre lors de projets technologiques.

Membrane filtration

source : http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lecture4-Microbio.htm

Filtration

Filtration 1

Filtration 2

Filtration 3

Filtration 4

Filtration 5

Filtration 6

Exemple obtenu sur gélose de Slanetz et Bartley : recherche et dénombrement des streptocoques fécaux

Gelose slanetz et bartley enterococcus faecalis

 

Ce milieu étant uniquement présomptif, il convient de transférer la membrane sur un milieu de confirmation : la gélose BEA (Bile-Esculine-Azide)

Gelose bea enterococcus faecalis

 

 

5ème partie : dénombrement des coliformes par filtration sur membrane

a venir

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Date de dernière mise à jour : 04/04/2017

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