Immunoprécipitation Simple - méthode de Mancini

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

L’immuno-précipitation (ou précipitation) est un phénomène au cours duquel des antigènes solubles se combinent avec des anticorps spécifiques pour former un réseau visible sous forme de précipités visibles à l’œil nu.

L’antigène soluble dans l’eau est généralement une protéine ou un polyoside

Immunoprecipitation schema moleculaire

La réaction de précipitation est maximale pour un rapport Ag/Ac précis : le système est alors à l’équivalence, le réseau formé est complet.

La réaction de précipitation peut être inhibée par un excès d’Ac ou d’Ag, le réseau est alors incomplet: c’est le phénomène de zone (source : technique d'immunologie, CRDP édition Aquitaine)

Immunoprecipitation courbe de zone 2

 

Les réactions de précipitation sont très sensibles à ce phénomène, d’où la nécessité de travailler avec des dilutions différentes de l’Ag ou de l’Ac à étudier

 

Dosage d'une biomolécule par immunodiffusion simple (méthode de Mancini)

Le contexte est ici simulé : il s'agit d’effectuer le dosage de la Serum-Albumine Bovine (SAB ou ASB) par l'utilisation d'anticorps inclus dans une gélose.

La réalisation est ici également simulée  :  un artifice de préparation permet d'obtenir (en moins de trente minutes) des arcs de précipitations ressemblant (plus ou moins...) à des arcs de précipitations dus à des immuns-complexes.

C’est une précipitation par diffusion simple car un seul de réactifs (Ag ou Ac) diffuse dans le milieu gélosé jusqu’à établir un gradient de concentration.

Le plus souvent :
- les anticorps sont contenus dans le gel ; leur concentration est donc constante ;
- une gamme étalon de dilutions d’une solution antigénique de concentration connue est déposée dans une série de puits creusés dans le gel ; l’antigène va donc diffuser en formant un gradient de concentration concentrique (radial) décroissant en s’éloignant du puits.
Mancini principe 2

Un anneau de précipitation, résultant de la formation d’un réseau Ag-Ac, se forme en 24 à 48 heures à température ambiante en chambre humide autour du puits à l’endroit où la concentration en Ag est optimale par rapport à la concentration en Ac (concentrations à la zone d’équivalence).
 

Préparation de la gamme d’étalonnage 

 

Etalon 1

Etalon 2

Etalon 3

Etalon 4

Vsol mère d’ASB

à 5 mg.mL-1 (μL)

12,5

25

50

100

VTampon PBS  (μL)

87,6

75

50

0

ρ (ASB ; sol) en mg.mL-1

0,625

1,25

2,5

5

 

1. Vérifier la concentration en sérum-albumine bovine (ASB) dans chacune des solutions étalon.

 

Test mancini 2018 zn 1m naoh 5 m annote

 

2. Reproduire et compléter le tableau suivant :

 

Étalon 1

Étalon 2

Étalon 3

Étalon 4

E1

E2

ρ (ASB ; solution) en mg.mL-1

 

 

 

 

 

 

Diamètre mesuré D en mm

 

 

 

 

 

 

D2 en mm2

 

 

 

 

 

 

 

3. Tracer sur tableur-grapheur la droite d’étalonnage D² = f (ρ(ASB ; sol. étalon) en mg/mL) puis :

  • Afficher le coefficient directeur et l'ordonnée à l’origine
  • Tracer la droite (si besoin en passant par le point moyen G et l’ordonnée à l’origine)

Remarque : la droite ne doit pas passer par le zéro.

4. Déterminer, à l'aide des paramètres de la droite, la concentration en ASB de la solution à doser pour chacun des deux essais.
 

5. Vérifier la compatibilité des valeurs mesurées (srρ = 0,14 mg.mL-1).

6. Exprimer le résultat de mesure (uc = 0,12 mg.mL-1)

 

Autre exemple de résultats :

Mancini truque

 

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Date de dernière mise à jour : 02/01/2019