Objectifs :

• Réaliser une réaction antigène-anticorps pour mettre en évidence un Ag ou un Ac
• Réaliser une méthode immunologique de quantification : mettre en œuvre une gamme de dilution géométrique
• Choisir les témoins pour valider la technique : témoins de spécificité, témoin d'efficacité

La syphilis est avant tout une infection transmissible sexuellement (ITS) causée par la bactérie Treponema pallidum. La maladie possède plusieurs apparences cliniques souvent regroupées en stades, selon le moment où elles se produisent :

Le tréponème ne se cultivant pas in vitro, le diagnostic de syphilis ne peut se faire que :

• par la mise en évidence du tréponème lui-même au microscope à fond noir ;
• indirectement, par la mise en évidence de la réponse spécifique anticorps.

L’objectif est de déterminer la concentration en anticorps anti-Treponema pallidum dans un sérum à tester afin de confirmer ou infirmer un diagnostic de syphilis.

Autrefois, la syphilis était une cause importante de mortalité et d'invalidité. On pense qu'elle a été introduite en Europe par les premiers explorateurs espagnols de retour d'Amérique. Elle s'est répandue à travers l'Europe et est devenue associée à la sexualité et comme Vénus était considérée comme la « déesse de l'amour », on l'a désignée comme une maladie vénérienne (vénérienne étant un adjectif dérivé de Vénus). Il n'existait pas de traitement pour la syphilis avant la découverte des antibiotiques en 1945. Cette maladie est devenue plus rare depuis que leur usage s'est répandu mais elle est en augmentation ces dernières années.

• A l’aide du document 1, schématiser le phénomène moléculaire se produisant pour un test positif.

• Pour chacun des trois témoins (document 2), rappeler la composition qualitative et indiquer le résultat attendu (sédimentation ou hémagglutination) en justifiant ce résultat théorique.

• Rédiger une analyse des risques indiquant le danger, sa nature, trois situations exposantes, les mesures de prévention collectives et individuelles à mettre en œuvre.

DOCUMENT 1 - Principe du Treponema pallidum hemagglutination assay (TPHA)

Cette technique consiste à rechercher dans le sérum à analyser la présence d’anticorps spécifiquement dirigés contre les antigènes polyosidiques d’enveloppe de la bactérie Treponema pallidum, agent responsable de la syphilis. Pour cela, des hématies de poule ont été sensibilisées par des extraits d’antigènes d’enveloppe de Treponema pallidum (des antigènes externes de la bactérie T. pallidum ont été fixés sur la membrane d’hématies) : il s’agit donc d’une technique d’agglutination passive directe.
Les anticorps éventuellement présents dans le sérum vont s’unir aux hématies de poule sensibilisées, provoquant l'hémagglutination des particules, visible facilement à l'œil nu.

DOCUMENT 2 - Procédure opératoire du sérodiagnostic quantitatif par le test du TPHA

Matériel et réactifs pour le test du TPHA

• Microplaque à 96 micropuits à fonds ronds et parafilm pour couvrir
• Pipettes à piston + cônes adaptés
• Diluant isotonique A tube BLANC                                                                    
• Hématies test (hématies de poule sensibilisées avec l’Ag de T. pallidum) tube ORANGE      
• Hématies contrôle (hématies non sensibilisées) tube VERT                               
• Sérum contrôle positif prédilué au 1/20 tube BLEU                                            
• Sérum contrôle négatif prédilué au 1/20 tube JAUNE                                       
• Sérum inconnu à analyser tube ROSE                                                                 

Dans la plaque de microtitration à fond rond, réaliser les opérations indiquées dans le tableau ci-dessous (en réalisant ligne par ligne).
ATTENTION A BIEN HOMOGENEISER LES HEMATIES AVANT UTILISATION

• Homogénéiser la plaque 30 secondes à la main ou sur agitateur orbital
• Couvrir et laisser reposer, à l’abri de toute source de chaleur et de vibrations, sur un papier humide afin de neutraliser les forces électrostatiques.
• Lire après au moins 45 minutes. La réaction reste stable pendant 24h

• Calculer la dilution finale du sérum à tester dans chacun des puits de la gamme de titration (attention : il y a deux dilutions à prendre en compte pour chaque tube de la gamme)

• Rédiger un tableau de résultats montrant le résultat obtenu (observation) et l’interprétation.

• Valider (ou non) la procédure opératoire à l’aide des témoins.

• Indiquer le n° de la cupule qui permet de déterminer le titre du sérum X. Justifier la réponse.

• Indiquer le titre du sérum X. Conclure par rapport à la norme

DOCUMENT 3 - Lecture et interprétation du sérodiagnostic quantitatif par le test du TPHA

Interprétation et conclusion
Le titre du sérum correspond à l’inverse de la plus grande dilution pour laquelle il y a encore agglutination.