Identification d'un micro-organisme pathogène en biologie médicale par technique PCR
Objectif :
-Identifier l'agent responsable d'une pathogolie infectieuse par la technique PCR.
-Vérifier l’efficacité et la spécificité d’une procédure d’identification bactérienne par la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction),
Les amplicons (fragment d'ADN amplifié par PCR obtenus seront analysés par électrophorèse sur gel d’agarose.
Le contexte vise à sensibiliser les élèves sur une pathologie qui reste méconnue en France malgré son incidence, notamment dans certaines régions : la maladie de Lyme ou borreliose de Lyme.
Photo 1 : Borrelia burgdoferi, bactérie spirochète responsable de la maladie de Lyme
REMARQUE ESSENTIELLE : la PCR mise en oeuvre dans cette activité n'a pas consisté à amplifier un gène spécifique de cette bactérie.
Un kit de PCR commercial a été utilisé afin d'obtenir un résultat positif MAIS ne correspondant pas à la réalité.
La maladie de Lyme est une infection bactérienne due à un spirochète, Borrelia burgdorferi. C’est une anthropozoonose, transmise à l'homme par la piqûre de tiques femelles du genre Ixodes, par l’intermédiaire de leur salive (au plus la tique reste fixée longtemps, au plus le risque de transmission augmente).
Ces tiques parasitent une grande variété d’hôtes : petits mammifères (surtout des rongeurs) ou plus gros (cervidés, ovins, bovins). L’homme et les animaux domestiques constituent des hôtes accidentels.
Cette maladie est répandue mondialement, avec une incidence moyenne en France de 9 cas par an pour 100 000 habitants, soit quelques milliers de cas par an en France, mais le taux d’infestation est le plus élevé dans l’est de la France.
Le diagnostic peut se faire de deux façons (cf. ci-dessous) mais reste délicat et de nombreux tests sont critiqués pour leur manque de fiabilité.
Le scan du document ci-dessus avec l'application Aurasma (site qui n'est malheureusement plus actif, j'ai perdu des dizaines d'heures de travail non récupérable) permet d'en savoir plus (symptomes, répartition géographique, suivi d'une vidéo de présentation de la pathologie par un médecin).
Compléter le tableau de manipulation suivant ; pour cela :
- repérer le volume final contenu dans le microtube ;
- calculer Vtampon 5X à ajouter dans le microtube ;
- calculer VMgCl2 à ajouter dans le microtube pour compléter.
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Réactifs |
Volumes à ajouter en µL |
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Volume de tampon de réaction PCR 5X |
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Volume de MgCl2 qsp 25 µL |
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Volume d’amorces Am1 et Am2 |
5 |
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Volume de solution de désoxyribonucléotides (dNTPs) |
5 |
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Volume de Taq polymérase à 1,25 U · µL-1 |
1 |
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Volume d’ADN de Borrelia burgdorferi à amplifier1 ng · µL-1 |
4 |
Indiquer la composition qualitative et quantitative :
- d’un témoin négatif PCR (sans ADN) ;
- d’un témoin de spécificité (prouvant que les amplicons obtenus sont spécifiques à la bactérie Borrelia burgdorferi).
Calculer la température d’hybridation de chacune des deux amorces sur la séquence d'ADN à amplifier à l’aide du document suivant puis valider ou invalider la température d'hybridation TH proposé en vérifiant si elle répond aux deux conditions citées.
Séquence de l’amorce Am1 : 5'- TGCGGCTGAAGAAGAGATC - 3' amorce sens
Séquence de l’amorce Am2 : 5'- AGGCTTGGGACAGACAAGG - 3' amorce anti-sens
Calcul de la température de fusion Tm d'une amorce en degrés Celsius
Conditions de choix de la température d'hybridation :
1) Les deux amorces doivent avoir un proche, l'écart entre les deux températures de fusion doit être inférieure ou égal à 2 °C (Δ Tm ≤ 2 °C)
2) La température d'hybridation TH de l'ADN cible doit être légèrement inférieure aux Tm de chacune des deux amorces (Tm amorce X - TH < 5 °C)
Compléter le schéma montrant comment la PCR permet d’amplifier une séquence connue d’ADN :
Annoter l’électrophorégramme (titre, bornes et sens de migration, composition du contenu des puits, conditions de migration, molécules du marqueur de taille).
Gel à 0,7 % d'agarose (m/V) :
-puits 1 (à gauche, peu visible) : témoin négatif
-puits 2 : témoin de spécificité (matrice = ADN génomique d'une autre espèce bactérienne)
- puits 3, 4, 6, 7, 8 : produits de la PCR réalisée par les élèves
- puits 9 : témoin positif
- puits 5 : marqueur de taille "GeneRuler 1 kb DNA ladder"
Gel à 1,2 % d'agarose (m/V) :
- puits 1 : témoin de spécificité
- puits 2 : témoin négatif
- puits 3, 4, 6 : produits de la PCR réalisée par les élève
Présenter sous forme de tableau les observations des amplifications pour :
- le témoin négatif,
- le témoin de spécificité,
- le témoin positif,
- l'amplification réalisée par le binôme.
Indiquer, pour chaque piste : le nombre de bandes obtenues, leur position par rapport au marqueur de taille.
Analyser chacun des trois témoins et conclure sur leur conformité respective.
Valider (ou non) la PCR réalisée.
Commenter l'amplification réalisée par le binôme. Conclure quant à l'échantillon analysé.
– PCR de détection (diagnostic ?) : celle qui vous permet de croire que vous avez dans votre extraction l’agent infectieux que vous tâchez de cibler
– PCR de monitoring : celle qui vous suffit pour admettre que vous validez ou non l’expérience que vous désirez suivre, celle qui vous dit que vous avez contaminé votre extraction d’ARN en ADN génomique, par exemple
– PCR de production : celle qui vous permet d’obtenir le plus de produit spécifique afin d’exploiter ces quelques centaines de paires de bases pour en faire ce que vous avez imaginé (reporters à spotter sur puce ADN ou insert pour un clonage)
– PCR quantitative : celle qui se résume à estimer du mieux possible la quantité d’acides nucléiques ciblés présents initialement dans une PCR (cDNA, cible pathogène…).
Date de dernière mise à jour : 02/06/2024
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