Recherche de bactériophages

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Paris match -  lundi 4 février 2013
Ils sont présents partout autour de nous et nous en respirons sans le savoir. Ces virus, 50 à 100 fois plus petits que les bactéries, sont indispensables à l’équilibre naturel de notre écosystème. « Pour réaliser nos travaux de recherche, nous allons les chercher dans les stations d’épuration des eaux usées de la région parisienne », explique Laurent Debarbieux, de l’Institut Pasteur. Contrairement aux antibiotiques qui combattent les infections sur un large spectre, les phages sont spécifiques et se concentrent sur la bactérie qu’ils vont engloutir. « En fait, c’est le matériel génétique des phages qui s’introduit dans la bactérie, poursuit-il. On assiste à une reprogrammation de la bactérie qui devient une usine à fabrication de phages. » Une véritable armée se constitue et détruit la bactérie responsable en moins de trente minutes.
Mais, comme pour les antibiotiques, une résistance aux phages est toujours possible. « C’est un principe naturel des bactéries que de s’adapter à l’intrus et de résister en reconnaissant l’ennemi, ajoute-t-il. Mais, face à cette résistance nouvelle, on peut concevoir des cocktails de trois à dix phages et contourner cette embûche. » Une façon de permettre à la phagothérapie d’avoir toujours une longueur d’avance sur les bactéries, contrairement aux antibiotiques.
Ces phages, ici en jaune, étudiés à l’Institut Pasteur, vont venir à bout d’une bactérie. Photo grossie 50 000 fois. | Photo Institut Pasteur

Les objectifs sont donc :  
-    de rechercher la présence, dans un échantillon d’eau, de bactériophages capables d'infecter diverses espèces de bactéries et de mettre en évidence leur effet antibactérien naturel comparable à celui d'un antibiotique ;
-    de titrer les phages (si on en trouve) dans l'échantillon d'eau étudié

Phages

 

Procédure opératoire 

 

T1.      Prélèvements d'échantillons d'eau (Jour -1)

  • Recueillir 1 ou 2 échantillons d'eau différents en suivant les consignes suivantes  :

Les phages sont présents partout où sont présentes les bactéries ! Plus le cours d’eau est "sale", plus il y a de chance d’avoir des bactériophages. Un prélèvement en aval de la sortie d’une station d’épuration est également envisageable, de même que dans une rivière ou une fontaine)

  1. Prélever 500 mL d'eau en flacoN stérile fermer et noter la provenance exacte de l’échantillon sur le flacon (Utiliser Google Maps pour relever les coordonnées exactes ; noteur l'heure et la date de prélèvement)

 

T2.      Élimination des bactéries des échantillons par filtration sur membrane (par 4 – Jour 0)

  • Éliminer les bactéries des échantillons d'eau en suivant les consignes suivantes :
  1. Filtrer, en conditions aseptique, un volume Véchantillon eau = 100 mL avec la rampe de filtration sur une membrane de porosité 0,45 µm, en suivant les consignes de la FT "Filtration de bactériophages".
  2. Récupérer le filtrat dans un nouveau flacon stérile de 100 mL noté F.
  • Rédiger une schéma légendé expliquant quels sont les éléments filtés et les élements retenus sur la membrane
  • Justifier le fait de jeter la membrane après filtration.

Filtration 5

 

T3.      Enrichissement en bactériophages dans les échantillons (par élève – Jour 0)

  • Procéder à l'enrichissement en bactériophages, éventuellement présents dans les eaux, en suivant les consignes suivantes :

Souches bactériennes (classe 1) :
à Gram négatif : Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens
à Gram positif : Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis

  1. Prélever 9 mL du filtrat F et les transférer dans 1 tube à essai stérile noté E (pour "enrichissement")
  2. Conserver le volume restant du filtrat F à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
  3. Ajouter 1 mL de milieu Luria Broth LB 10x (concentré dix fois) aux 9 mL d’eau filtrée du tube E.
  4. À l’aide d’une anse stérile, prélever un peu d'une culture bactérienne (parmi les quatre au choix) et la resuspendre dans les 10 mL de solution du tube E.
  5. Fermer le tube et Incuber 24 h à 37 °C
  • Calculer la concentration finale du milieu LB 10x après ajout du filtrat.
  • Justifier d'après les étapes 1 à 5, que cette phase T3 puisse permettre d'augmenter la concentration en bactériophages (dans le cas d'un phage lytique).
  • Indiquer quel témoin de croissance pourrait être réalisé en parallèle pour montrer que la bactérie-test se développe bien dans le bouillon nutritif.
  • D'après sa terminologie, quel estr la conséquence de l'infection d'une bactérie par un bactériophage lytique qui lui est spécifique.
  • En déduire l'aspect, après 24 h d'incubation, d'un bouillon nutritif, inoculé par une bactérie-test et dans lequel on aurait introduit un bactériophage lytique spécifique de cette bactérie.

 

T4.      Élimination des bactéries du bouillon d'enrichissement par filtration (par élève - jour 1)

  • Éliminer les bactéries des bouillons d'enrichissement en suivant les consignes suivantes :
  1. Filtrer 5 mL du milieu d’enrichissement, en condition aseptique avec les seringues de filtration, en suivant les consignes de la FT "Filtration de bactériophages".
  2. Récupérer le filtrat dans un tube à hémolyse stérile noté EF. Parafilmer.
  3. Le filtrat EF peut être gardé à 4 °C. Les bactériophages sont relativement stables et la préparation peut être conservée au moins une année dans ces conditions

Photographie du système de filtration individuel :

Systeme filtration individuel

Phage filtration bouillon enrichissement

Filtration du bouillon d'enrichissement (E. coli + fragment de gélose issu d'une plage de lyse, donc contenant des phages) dans la seringue, sur une membrane de porosité 0,45 µm.
Le filtrat est clair, montrant que les bactéries ont été retenues sur le filtre.
Contient-il des phages ? 

  • Calculer la concentration finale du milieu LB 10x après ajout du filtrat.
  • Justifier d'après les étapes 1 à 5, que cette phase T3 puisse permettre d'augmenter la concentration en bactériophages (dans le cas d'un phage lytique).

 

T5.      Préparation des échantillons à tester pour la recherche de phages (par élève – Jour 1)

  • Diluer le filtrat du tube EF en suivant les consignes suivantes :
  1. Diluer en série jusqu'à 10-6 le filtrat EF sous un volume final de 200 µL en tubes Eppendorf stérile.
    Diluant = eau distillée stérile à 11,4 g·L-1 de CaCl2 (les ions calcium facilitent l’adsorption du phage sur les récepteurs bactériens)
  • Calculer le volume de filtrat ED à prélever pour préparer la première dilution, puis les dilutions suivantes.

  •  

T6.      Préparation des milieux de culture (par binôme – Jour 1)

  • Préparer les milieux de culture en suivant les consignes suivantes :
  1. Sur le fond d'une grande boite de Pétri stérile, tracer 1 cercle central de 1 cm de diamètre et fractionner la boite en 8 parts égales

Abaque depots spots

  1. Noter sur la tranche : numéro poste – nom bactérie testée – origine échantillon testé.
  2. Couler dans la boite de Pétri 15 mL de gélose "dure" Mueller-Hinton maintenue en surfusion à 55 °C.
  3. Laisser la gélose se solidifier (devenir mate).

 

T7.      Préparation des cultures bactériennes à tester (par élève – jour 1)

  • Préparer les cultures bactériennes en suivant les consignes suivantes :
  1. Sortir un tube de gélose molle Mueller-Hinton à 6 g.L-1, maintenue en surfusion à 55 °C.
  2. Laisser redescendre la température de quelques degrés (environ 45 °C) ==> tenable à main nue
  3. L'inoculer avec 0,2 mL de la même suspension bactérienne que celle utilisée dans le protocole 3.
  4. Homogénéiser rapidement le contenu du tube (vortex).
  5. Couler immédiatement la gélose molle inoculée sur la gélose dure solidifiée. Laisser solidifier.
  6. Réaliser un isolement de la souche testée, à partir du bouillon, sur une gélose Mueller-Hinton en petite boite de Pétri
  • Expliquer pourquoi il est impératif d'utiliser la même bactérie que celle de l'étape d'enrichissement.
  • Proposer une hypothèse sur la nécessité d'utiliser une gélose "molle", sachant que les phages ne sont pas dotés de mobilité.

 

T8.      Dépôt des échantillons d'eau à tester pour la recherche de phages : technique des spots (par élève – Jour 1)

  • Effectuer les dépôts en suivant les consignes suivantes :
  1. Noter au dos de la boite les numéros ou noms des échantillons qui vont être déposé
  2. Déposer lentement au centre 5 μL (P10 + cône stérile) d’eau physiologique stérile (contrôle négatif)
  3. Déposer lentement dans un premier secteur 5 μL (P10 + cône stérile) de l’eau filtrée non enrichie F.
  4. Déposer ensuite lentement, dans chaque secteur restant, 5 μL de l’enrichissement filtré EF de la dilution la plus élevée (EF dilué à10-6) à la dilution la plus faible (EF non dilué) avec le même cone.
  5. Laisser les dépôts sécher sur la gélose pendant quelques minutes sans la secouer. Quand la goutte de 5 μL a complètement disparue, incuber la boite à l’envers à 37 °C pendant 18 à 24 h.
  6. La boite peut être conservée ensuite à 4°C

Phage methode des spots 2

Schéma de la procédure opératoire (à compléter avec le choix d'instruments de mesure volumétrique adaptés)

Remarque : le schéma et les photos de résultats montrent une procédure dans laquelle seules les dilutions allant jusqu'à 10-3 sont testées

Phages 1

 

Résultats obtenus (eau testée : échantillon prélevé en surface, le 20 septembre, dans la Sarre, coordonnées : 9°07'39.7"N 7°02'42.1"E)

Bactérie-test : Escherichia coli

Recherche phages bacterie test escherichia coli verso 1

eau NE = eau de rivière filtrée, sans enrichissement en phages (non testé car le filtrat restant avait été jeté)

EF = bouillon d’enrichissement après filtration

EF 1/10 = bouillon d’enrichissement après filtration dilué au 1/10ème

EF 1/100 = bouillon d’enrichissement après filtration dilué au 1/100ème

EF 1/1000 = bouillon d’enrichissement après filtration dilué au 1/1000ème

EMB = erreur d’écriture, il s’agissait d’eau qualité biologie Moléculaire stérile (qu’il fallait utiliser)

 

Autres bactéries-test : Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Staphylococcus epidermidis

Win 20170929 13 34 46 pro

1) Que peut-on observer ?

2) Qu'en déduire ?

3) Quels critiques faire quant aux dépôts de 5 µL

 

Voici un aure exemple de résultat que l'on peut obtenir.

 

Suite des manipulations, faites en dehors des heures d'activités mais pouvant constituer un prolongement intéressant à faire avec les élèves si le temps le permet :

Des bactériophages se sont donc multipliés en infectant des bactéries incluses dans la couche de gélose "molle".
Après avoir découpé un fragment de gélose dans lequel on a pu voir que les phages se sont multipliés par l'apparition de plages de lyses, ces fragments sont introduits dans un bouillon nutritif préalablement inoculé avec la bactérie hôte spécifique de ce phage.

Photo : découpage d'un carré de gélose dans la plage de lyse :

Recherche phage decoupe gelose

 

Vidéo : on peut voir 4 fragments de gélose : j'ai découpé deux petits carrés de géloses dans des zones de plage de lyse, mais chaque carré était constitué de deux couches : une couche de gélose dure et une couche de gélose molle, raison pour laquelle on peut voir 4 fragments (les deux couches se sont séparées après homogénéisation à l'agitateur vortex)

L'objectif est d'infecter les bactéries présentes dans le bouillon par les phages inclus dans la gélose.

A midi, deux bouillons nutritifs stériles ont été inoculés avec un même volume d'une culture d'Escherichia coli, pour laquelle nous avions trouvé des bactériophages spécifiques dans l'eau de riviere.
La turbidité était similaire après inoculation.
Le tube de gauche constitue le témoin de croissance.
Le tube de droite contient les fragments de gélose molle dans lesquels sont inclus les phages spécifiques d'E. Coli issus de l'activité de la semaine derniere.
Après seulement 5 h d'incubation à 37 °C, on constate un trouble important dans le tube témoin de croissance, mais un trouble plus faible dans celui contenant en plus la gélose incluant les phages

Amplification phage vs temoin sans phage

Etapes suivantes :

- Après 18 h d'incubation, filtration sur membrane de 0,45 µm du bouillon d'enrichissement (bactérie + phages) afin d'obtenir un filtrat ne contenant plus que les phages,

-Réalisation de dilution en série jusqu'à 10-12.

- Dénombrment par la technique de référence : incorpation dans 10 mL de gélose molle en surfusion de 200 µL de la bactérie sensible + 100 µL de chacune des cinq dernières dilutions.

-Résultat obtenu après seulement 5 h d'incubation à 37 °C :

Phages comparaison dilutions

 

Et la dernière diklution (géloose scannée avec l'appareil Geldoc EZ de Biorad)

Plages lyse 10 12

 

Ajouter un commentaire

Vous utilisez un logiciel de type AdBlock, qui bloque le service de captchas publicitaires utilisé sur ce site. Pour pouvoir envoyer votre message, désactivez Adblock.

Date de dernière mise à jour : 12/10/2017

×