Recherche de bactériophages

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Paris match -  lundi 4 février 2013
Ils sont présents partout autour de nous et nous en respirons sans le savoir. Ces virus, 50 à 100 fois plus petits que les bactéries, sont indispensables à l’équilibre naturel de notre écosystème. « Pour réaliser nos travaux de recherche, nous allons les chercher dans les stations d’épuration des eaux usées de la région parisienne », explique Laurent Debarbieux, de l’Institut Pasteur. Contrairement aux antibiotiques qui combattent les infections sur un large spectre, les phages sont spécifiques et se concentrent sur la bactérie qu’ils vont engloutir. « En fait, c’est le matériel génétique des phages qui s’introduit dans la bactérie, poursuit-il. On assiste à une reprogrammation de la bactérie qui devient une usine à fabrication de phages. » Une véritable armée se constitue et détruit la bactérie responsable en moins de trente minutes.
Mais, comme pour les antibiotiques, une résistance aux phages est toujours possible. « C’est un principe naturel des bactéries que de s’adapter à l’intrus et de résister en reconnaissant l’ennemi, ajoute-t-il. Mais, face à cette résistance nouvelle, on peut concevoir des cocktails de trois à dix phages et contourner cette embûche. » Une façon de permettre à la phagothérapie d’avoir toujours une longueur d’avance sur les bactéries, contrairement aux antibiotiques.
Ces phages, ici en jaune, étudiés à l’Institut Pasteur, vont venir à bout d’une bactérie. Photo grossie 50 000 fois. | Photo Institut Pasteur

Les objectifs sont donc :  
-    de rechercher la présence, dans un échantillon d’eau, de bactériophages capables d'infecter diverses espèces de bactéries et de mettre en évidence leur effet antibactérien naturel comparable à celui d'un antibiotique ;
-    de titrer les phages (si on en trouve) dans l'échantillon d'eau étudié (si celle-ci en contient)

 

 

Phages

 

Procédure opératoire (travail en binôme)

 

T1.      Préparation des milieux de culture (par binôme)

 8 géloses "dures" en tubes sont maintenues en surfusion à 55 °C en bain thermostaté.
Sur le fond d'une grande boite de Pétri stérile, tracer 4 cercles de 2 cm de diamètre,

  1. parfaitement espacés, ni trop près ni trop proches du bord.
  2. Noter sur la tranche : noms élèves – nom bactérie testée – origine eau testée.
  3. Couler, dans la boite de Pétri, une gélose "dure" maintenue en surfusion à 55 °C.
  4. Laisser la gélose se solidifier (devenir mate).

 

T2.      Préparation des souches bactériennes à tester (par binôme)

8 géloses "molles" en tubes sont maintenues en surfusion à 55 °C en bain thermostaté.

Souches bactériennes : Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis.

  1. Sortir un tube de gélose molle du bain thermostaté.
  2. Laisser redescendre la température de quelques degrés (environ 45 °C).
  3. Ajouter alors dans le tube 0,2 mL d'une suspension bactérienne préalablement choisie.
  4. Homogénéiser le contenu du tube (vortex).
  5. Couler la gélose molle inoculée sur la gélose dure (préalablement solidifiée).

 

T3.      Préparation des échantillons d'eau à tester pour la recherche de phages (par binôme)

  1. Diluer jusqu'à 10-3 l'eau à tester (dans laquelle on recherche des bactériophages) sous un volume final de 1 mL en tubes à hémolyse stérile (diluant = eau physiologique stérile).

 

T4.      Dépôt des échantillons d'eau à tester pour la recherche de phages (par binôme)

  1. Utiliser une pipette à piston et des cônes stériles pour déposer, dans chacun des cercles préalablement identifiés, 10 µL de l'eau non diluée et de chacune des dilutions.
  2. Laisser sécher en spot.
  3. Incuber 48 h à 37 °C.

 

Organigramme de la manipulation (à compléter avec le choix d'instruments de mesure volumétrique adaptés)

Technique spot

 

Résultats obtenus (eau testée : échantillon prélevé en surface, le 5 septembre, dans la Sarre, coordonnées : 49°09'58.7"N 7°01'46.3"E)

à venir !

La recherche a été effectuée vis à vis de 5 espèces bactériennes différentes, mais, à J+5, aucune mise en évidence de plages de lyse sur les milieux de culture :(
Manipulation à refaire, mais voici le type de résultat que l'on peut obtenir.

 

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Date de dernière mise à jour : 11/02/2017

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