Dosage Immuno-enzymatique ELISA

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

La technique de dosage d’immuno-absorption par enzyme liée (en anglais : Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ou ELISA, rien à voir avec la fabulse chanson de Serge Gainsbourg) est principalement utilisée en immunologie afin de détecter et/ou doser la présence d'anticorps ou d'antigènes dans un échantillon.

Il existe plusieurs types de tests ELISA. Cette animation (en anglais très accessible) permet d'en comprendre le(s) principe(s).

Le principe de l’ELISA indirect (test couramment réalisé en laboratoire d'analyse de biologie médicale) consiste à détecter la présence d’un anticorps spécifique dans le sérum d'un patient. Pour cela, il faut :

  • un antigène connu et  spécifique de l’anticorps recherché ;
  • un échantillon à analyser ;
  • un  anticorps  secondaire  anti- IgG  couplé  à  une  peroxydase  (cet  anticorps  va reconnaitre spécifiquement les anticorps IgG) ;
  •  un substrat chromogène spécifique à l’enzyme utilisée.

 

La technique ELISA est notamment  utilisée  pour  le  dépistage  de différents virus, comme le VIH ou le VHB : ce test de dépistage s’effectue en deux étapes :

  • la première étape est un test ELISA permettant :
    • de déterminer la présence ou l'absence d’un antigène spécifique du virus ;
    • de déterminer la concentration sérique des anticorps produits par l’organisme et dirigés contre le virus, par comparaison à une valeur seuil.  
  •  la deuxième étape est un test de confirmation par immuno-transfert (Western-blot) : après séparation électrophorétique des protéines, celles-ci sont transférées sur une membrane puis des anticorps spécifiques de la protéine à rechercher (couplés à une enzyme comme la peroxydase) sont ajoutés pour révéler la protéine recherchée (voir cette animation réalisée par une élève de Terminale S)
  • Après avoir mis en évidence de façon qualitative la présence d’antigènes HBs dans un sérum de donneur de sang (AT19 (1) par la technique d’Ouchterlony), l’objectif est de déterminer le titre[1] en anticorps anti-HBs dans le sérum de ce donneur, par la technique de micro-titration sur plaque (technique ELISA indirecte)

[1] Concentration d’anticorps, établie par un test de dilution en série du sérum.

 

1ère partie : préparation des solutions et réactifs

1. Principe de l’ELISA indirect appliqué au diagnostic d'un antigène viral (par ex. du virus de l’hépatite B)
Indiquer quel va être la molécule utilisée dans ce test pour rechercher les anticorps spécifiquement dirigés contre le virus VHB.

Structure vhb 4

 

2. Préparation du tampon PBS 1X (Phosphate Buffered Saline)

  1. Rappeler ce qu’est une solution tampon.
  2. Calculer le facteur de dilution « F » à réaliser pour préparer du tampon PBS 1X à partir d’une solution mère de PBS 10X.

 

3. Préparation de la gamme d’anticorps humains anti- HBs de concentration C1 à (pour la gamme d'étalonnage)

  • à partir de la solution C1 à 17 µg d'Ac anti-HBs.mL-1 de sérum, réaliser en microtubes Eppendorf une dilution en cascade :
    • de raison ½ jusqu’à 1/128 ;
    • sous un volume final de 200 µL ;
    • diluant : PBS 1X.
      Remarque : ne pas rejeter le volume en excès du dernier tube.
  1. Justifier la nécessité d’utiliser une solution tampon pour diluer des protéines anticorps.
  2. Justifier la température indiquée pour la conservation d’une solution d’anticorps.
  3. Justifier par le calcul le volume de C1 à prélever pour préparer la première dilution C2
  4. Schématiser la réalisation de la gamme d’anticorps anti-HBs ; indiquer :
    • le nombre de tubes Eppendorf nécessaires pour atteindre une dilution au 1/128ème 
    • le volume de diluant présent dans chaque tube
    • le volume transféré entre chaque tube
    • la dilution et la concentration en Ac anti-HBs obtenue dans chaque tube

 

4. Préparation de la solution d’anticorps de détection (= anticorps conjugués) : Ac de lapin anti-immunoglobulines humaines couplés à la peroxydase
Indiquer sur quelle molécule peuvent se fixer ces anticorps conjugués.

 

5. Préparation du sérum non-immunisé (témoin négatif)
Justifier l’appellation « témoin négatif » pour ce sérum.

 

6. Étape de « coating » (fixation de l'antigène sur les parois)

  1. Indiquer si la fixation de l’antigène sur la paroi en plastique des puits est un phénomène très spécifique ou peu spécifique, et le type d’interactions mises en jeu.
  2. Justifier la nécessité d’utiliser une solution concentrée d’HBs pour « coater » les puits (c'est-à-dire fixer l'antigène dans les puits).

 

7. Rédiger un tableau d’analyse a priori des risques liés à la procédure opératoire.

Dangers elisa

 

2ème partie : titrage des Ac anti-HbS dans un sérum

La procédure détaillée fourni dans le sujet permet de compléter le schéma suivant :

Elisa etapes

 

Résultat obtenu :

  • puits 1 à 6 : gamme étalon comprenant les concentrations C1, C2, C4, C5, C6, C8 (attention : les concentrations C3 et C7 ont bien été préparées mais pas utilisées)
  • puits 7 : témoin négatif
  • puits 8: sérum à tester

Gamme, témoin négatif et échantillon (manip. 2017)

2017 elisa 1

 

Dans l'exemple ci-dessous, on peut constater la coloration bleu du témoin négatif (avec sérum non immun) alors qu'une absence de coloration est attendue (voir ci-dessus)

Elisa 2016 3

 

1. Justifier la nécessité d’effectuer les lavages des cupules après la fixation de l’anticorps primaire et après la fixation de l’anticorps de détection (anticorps secondaire).

2. Expliquer pourquoi l’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d’anticorps à doser.

3. Schématiser ce qui serait observé dans le cas d’une réaction négative (absence dans le sérum d’anticorps spécifiquement dirigés contre l’antigène HBs).

4. Analyse subjective : d’après  l’intensité  de  la  coloration  bleue  dans le puits contenant l’échantillon de sérum à tester, déterminer  le  titre  d’anticorps  anti-HBs (titre = inverse de la dilution).

5. Analyse objective : utiliser la photographie prise lors de la révélation et le logiciel MESURIM (suivre le tutoriel document 6) pour déterminer la concentration en anticorps anti-HBs.

Tutoriel Mesurim – Mesurer une intensité

  1. Lancer MESURIM (ou MESURIM PRO).
  2. Cliquer sur « Fichier » puis « Ouvrir » et choisir l’image de la barrette à analyser.
  3. Cliquer sur « Choix » puis « Outils de mesure » ; sélectionner « Lumière sur une bande ».
  4. Dans la fenêtre, indiquer « 5 » pour la largeur en pixels et cocher « Mesure en absorption ».
  5. Tracer une ligne passant par le milieu de chaque puits, au niveau de la solution colorée.
  6. Cliquer sur « Mesurer »
  7. Dans la fenêtre affichant le densitogramme, cliquer sur « Tableau » puis « Valeurs choisies »
  8. Sur la courbe (densitogramme), repérer une zone correspondant à la couleur bleue dans le puits puis cliquer sur le point de la courbe correspondant : dans le tableur apparait la première valeur indiquant la position et le % d’absorption de lumière.
  9. Recommencer pour chacun des 5 autres puits (C2, C4, C5, C6 et C8)
  10. Copier les valeurs depuis le tableau de Mesurim vers Excel ou Calc
  11. Dans une feuille de calcul, calculer les concentrations de chaque étalon et le logarithme décimale de chaque concentration et copier/ coller les % d’absorption relevés dans Mesurim.
  12. Tracer le graphe : % d’absorption = f(log concentration).
  13. Insérer la courbe de tendance (régression linéaire), afficher le coefficient de détermination R² ainsi que les paramètres de la droite.
  14. Calculer le logarithme de la concentration en anticorps dans l'échantillon A en utilisant les paramètres de la droite.
  15. Calculer la concentration en anticorps dans l'échantillon A : La fonction inverse de log est : =puissance(10;valeur du log) ou l'inverse selon le tableur utilisé : =puissance(valeur du log;10)

Elisa mesurim

Mon tutoriel d'utilisation de Mesurim est disponible ici : Liens

 

Le graphe attendu est le suivant : 

Elisa tableur

 

Remarques :

  • La qualité des mesures d'absorption à partir d'une photo est évidemment de piètre qualité ; un mesurage exact nécessite :
    • soit le transfert en semi-microcuve de très petis volumes suivi d'une mesure de l'absorbance à de chaque solution colorée  à 450 nm.
    • soit l'utilisation d'un lecteur de micrtoplaque :

Elisa lecteur microplaque

 

 

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Date de dernière mise à jour : 19/05/2017

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