Immunoprécipitation double -Ouchterlony

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

L’immuno-précipitation (ou précipitation) est un phénomène au cours duquel des antigènes solubles se combinent avec des anticorps spécifiques pour former un réseau visible sous forme de précipités visibles à l’œil nu.

L’antigène soluble dans l’eau est généralement une protéine ou un polyoside

Immunoprecipitation schema moleculaire

La réaction de précipitation est maximale pour un rapport Ag/Ac précis : le système est alors à l’équivalence, le réseau formé est complet.

La réaction de précipitation peut être inhibée par un excès d’Ac ou d’Ag, le réseau est alors incomplet: c’est le phénomène de zone (source : technique d'immunologie, CRDP édition Aquitaine)

Immunoprecipitation courbe de zone 2

 

Les réactions de précipitation sont très sensibles à ce phénomène, d’où la nécessité de travailler avec des dilutions différentes de l’Ag ou de l’Ac à étudier

 

1ère partie : caractérisation immunologique d'une protéine par immunodiffusion double (méthode d'Ouchterlony)

Le contexte est ici simulé : il s'agit d’effectuer le dépistage du virus de l'hépatite B (VHB) par la recherche d'un antigène de surface (l'antigène HBs) sur quatre sérums, par la technique d’immunodiffusion radiale double.

La réalisation est ici également simulée  :  un artifice de préparation permet d'obtenir (en moins de trente minutes) des arcs de précipitations ressemblant (plus ou moins...) à des arcs de précipitations dus à des immuns-complexes.

Ouchterlony 1

Une solution d'antigène HBs a été déposée dans le puits central

20 µL de sérum (S1 à S4) ont été déposés dans les puits périphériques.

1. Interpréter les résultats obtenus entre le puits central et chacun des puits périphérique 

2. Indiquer ce que contiennent les sérums S1 et S4.

3. Expliquer ce que signifie la présence des molécules mises en évidence dans les sérums S1 et S4.

4. Conclure sur l'acceptation ou le rejet de chacun de ces sang par un Centre de Transfusion Sanguine

 

Remarque : la photo suivante montre de vrais arcs de précipitation entre un  antigène (albumine) et un anticorps spécifique (anticorps anti-albumine) .

La réaction est très lente : au moins 24 h, à température ambiante et en enceinte humide.

Ouchterlony albumine a completer 2

 

 

2ème partie : une alternative au dosage biochimique : le dosage immunologique par la technique d'immunodiffusion simple (méthode de Mancini)

L’immunodiffusion radiale (technique de Mancini)  fait appel à une réaction d’immuno-précipitation en milieu gélosé.
C’est une précipitation par diffusion simple car un seul de réactifs (Ag ou Ac) diffuse dans le milieu gélosé jusqu’à établir un gradient de concentration.

Le plus souvent :
- les anticorps sont contenus dans le gel ; leur concentration est donc constante ;
- une gamme étalon de dilutions d’une solution antigénique de concentration connue est déposée dans une série de puits creusés dans le gel ; l’antigène va donc diffuser en formant un gradient de concentration concentrique (radial) décroissant en s’éloignant du puits.

Mancini principe 2

Un anneau de précipitation, résultant de la formation d’un réseau Ag-Ac, se forme en 24 à 48 heures à température ambiante en chambre humide autour du puits à l’endroit où la concentration en Ag est optimale par rapport à la concentration en Ac (concentrations à la zone d’équivalence).
 

Préparation de la gamme d’étalonnage 

 

Etalon 1

Etalon 2

Etalon 3

Etalon 4

Vsol mère d’ASB

à 1,80 mg.mL-1 (μL)

100

150

200

100

VTampon PBS  (μL)

200

150

100

0

ρ (ASB ; sol) en mg.mL-1

 

 

 

 

 

1. Calculer la concentration en sérum-albumine bovine (ASB) dans chacune des solutions étalon.

 

Activité réalisée sous forme de TD à partir d'un sujet du bac STL 

Remarque : la photographie a été retravaillée pour mieux visualiser les anneaux de précipitation

Mancini a exploiter 2

 

2. Reproduire et compléter le tableau suivant :

 

Étalon 1

Étalon 2

Étalon 3

Étalon 4

E1

E2

ρ (ASB ; solution) en mg.mL-1

 

 

 

 

 

 

Diamètre mesuré D en mm

 

 

 

 

 

 

D2 en mm2

 

 

 

 

 

 

 

3. Tracer sur tableur-grapheur la droite d’étalonnage D² = f (ρ(ASB ; sol. étalon) en mg/mL) puis :

  • Calculer la pente, l’ordonnée à l’origine
  • Tracer la droite (si besoin en passant par le point moyen G et l’ordonnée à l’origine)

Remarque : la droite ne doit pas passer par le zéro.

4. Déterminer graphiquement la concentration en ASB de la solution à doser.
Déterminer par le calcul la concentration en ASB de la solution à doser. Comparer.

5. Vérifier la compatibilité des valeurs mesurées (srρ = 0,027 mg.mL-1).

6. Exprimer le résultat de mesure (uc = 0,06 mg.mL-1)

 

 

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Date de dernière mise à jour : 23/03/2017

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