Réduction de charge microbienne

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Les techniques de réduction de charge microbiennes sont nombreuses et utilisées dans les domaines de  l’agro-alimentaire, des cosmétiques, de la pharmaceutique, ou de la santé.

Pour juger de l’efficacité des traitements thermiques que sont la pasteurisation et la stérilisation, on utilise la courbe de destruction thermique des micro-organismes (cf. cours)

cN(microorganisme ;  milieu étudié) = f(t)

qui suit une loi mathématique de type exponentielle.

Une représentation semi-logarithmique de cette courbe permet sa linéarisation utile à la détermination du paramètre de thermorésistante Dθ : ce paramètre, appelé temps de réduction décimal, permet d’évaluer l’efficacité d’un traitement thermique sur une souche bactérienne ou fongique donnée

  • Le but de la séance est de vérifier une technique simple de stérilisation à destination de l'élimination de levures génétiquement transformées en laboratoire.
    Pour cela, il faut
    ​:
    réaliser une technique de réduction de charge microbienne ;
    calculer le temps de réduction décimal d’une pasteurisation

 

1ère partie : vérification de l'efficacité d'une procédure d'autoclavage sur une suspension de levures Saccharomycèes cerevisieae

  1. À partir d'une suspension de levures notée L (TOUJOURS CONSERVEE DANS LA GLACE)
  • Réaliser un étalement au râteau (cf. démo) de 0,1 mL sur gélose Sabouraud
  • Réaliser un frottis fixé coloré au bleu de méthylène. Observer .
  1. À partir d'une suspension de levures après autoclavage notée Lac.
  • Réaliser un étalement au râteau (cf. démo) de 0,1 mL sur gélose Sabouraud 
  • Réaliser un frottis fixé coloré au bleu de méthylène. Observer
  1. Donner une définition des levures.
    Préciser leur place dans la classification des micro-organismes.
  2. Comparer la suspension de levure avant/après autoclavage (aspect microscopique, aspect de l'étalement et dénombrement si possible)
  3. Rappeler les conditions utilisées (couple température/durée) pour l'autoclavage
    Conclure sur l'efficacité de l'autoclavage.

 

2ème partie : mise en oeuvre de la réduction de charge microbienne et dénombrement des cellules vivantes après traitement

cf. AT de 1ère pour les détails

  1. Cytométrie directe avant traitement thermique (manipulation individuelle)
  • Préparer une dilution de la suspension L au ½ dans du bleu de Funk dans un volume finale de 400 µL.
  • Homogénéiser. Laisser agir 1 à 2 minutes.
  • Remplir la chambre hématimétrique. Laisser sédimenter quelques minutes avant de réaliser le dénombrement.
  • Dénombrer en hématimètre de Malassez les cellules viables et non viables sur 4 rectangles (unités) de comptage.
    Remarque : si  il y a plus de 50 levures par rectangle, procéder à une dilution adaptée.

 

  1. Mise en œuvre d'un traitement thermique en bain thermostaté 

Binômes ..........................: traitement thermique : 50 °C

Binômes ..........................: traitement thermique : 55 °C

Binômes ..........................: traitement thermique :  60 °C

  • Régler le bain thermostaté à la température de travail. Vérifier au thermomètre à alcool
  • Introduire 0,5 mL de la suspension de levure dans 8 tubes à hémolyse en verre
  • Incuber à la température de travail chaque tube selon la durée suivante (respecter impérativement la durée de traitement

2 min

4 min

6 min

8 min

10 min

12 min 

14 min

16 min 

  • Transférer immédiatement dans la glace après le temps de traitement thermique afin de stopper l’effet de la chaleur
  1. Cytométrie directe après traitement thermique
  • Pour chaque durée de traitement thermique, procéder à un dénombrement comme dans la partie A.

 

  1. Justifier la nécessité de conserver les suspensions dans la glace :
    - durant la manipulation ;
    - immédiatement après le traitement thermique.
  2. Présenter le comptage des cellules (vivantes, mortes) avant le traitement thermique.
    Calculer (chaque calcul étant justifié par l'équation aux grandeurs et aux unités)
    - la concentration en nombre CN(levures vivantes ; suspension avant autoclavage) en levures/mL-1
    - le pourcentage de viabilité.
  3. Présenter sous forme de tableau (tableur-grapheur) :
    - le nombre total de levures vivantes dans les 4 rectangles de comptages
    - la concentration en nombre CN(levures vivantes ; suspension avant autoclavage) en levures/mL-1 en effectuant les calculs dans les cellules du tableur)
    - le logarithme décimal de la concentration en nombre de levures (en effectuant les calculs dans les cellules du tableur)
    - le facteur de réduction de la population (par rapport à la concentration initiale).
  4. A l’aide du tableur, créer un graphe montrant simultanément :
    - le nuage de points : CN(levures vivantes ; suspension) = f(temps)
    - le nuage de points : LogCN(levures vivantes ; suspension) = f(temps) (une droite devrait être obtenue)
  5. Déterminer le temps de réduction décimal Dθ qui correspond au temps nécessaire pour tuer 90 % des micro-organismes d’une population dans un échantillon à une témpérature spécifique, ce qui correspond à une réduction d’un facteur 10 de CN soit une unité Log(CN) la population microbienne.
  6. Comparer les graphes et valeurs obtenues pour chaque température de travail.

Exemple de valeurs obtenues

  durée de chauffage (min) 2 4 6 8 10 12
  levures vivantes 110 89 61 48 32 20
nombre de rectangles 4 4 4 4 4 4
volume comptage 0,00004 0,00004 0,00004 0,00004 0,00004 0,00004
CN 5,5E+06 4,5E+06 3,1E+06 2,4E+06 1,6E+06 1,0E+06
LogCn 6,74 6,65 6,48 6,38 6,20 6,00
  facteur de réducion 1,64 2,02 2,95 3,75 5,63 9,00
CN init = 9,0E+06            

 

Courbe primaire : CN(levures vivantes ; milieu étudié) = f (t)

Cinetique 50 degres

L'aspect de décroissanee exponentielle n'est pas clairement visible sur ces valeurs, expérimentales et donc non truquées, avec des dénombrements fait très rapidement (donc empreints d'une forte incertitude).

Une courbe de meilleure qualité (obtenue deux ans plus tôt) donne cet aspect :

Reduction microbienne 2 courbe primaire

 

Courbe secondaire semi-log : log CN(levures vivantes, milieu étudié) = f (t)

Cinetique 50 degres semi log

Cinetique 60 degres

Le coefficient de détermination  R² indique une régression d'assez mauvaise qualité mais néanmoins exploitable.
Il faudra toutefois extrapoler la droite pour déterminer le temps de réduction décimal.

Exploitation :

Tps reduction decimale 50 degres

Tps reduction decimale 60 degres

La courbe secondaire obtenue à partir de la courbe primaire obtenue il y a deux ans donne cet aspect :

Reduction microbienne 2 courbe semi log

A l'aide de cette courbe, déterminer graphiquement le temps de réduction décimale Dθ qui permet d’évaluer l’efficacité d’un traitement thermique sur une souche bactérienne ou fongique donnée.

Rappel : le temps de réduction décimal (différentes définitions)
1) est le temps permettant de réduire de 90 % la concentration en nombre d'une population
2) est le temps nécessaire pour ne laisser que 10 % de survivants d'une population
3) est le temps permettant de réduire d'un facteur 10 la concentration en nombre d'une population
4) est le temps permettant de réduire d'une unité log la concentration en nombre d'une population

 

3ème partie : Comparaison de l'efficacité de deux désinfectants

Il s'agit de réaliser l'étude comparée de l'efficacité de l'eau de Javel et du produit Amphospray ® (un mélange) détergent/désinfectant) sur une bactérie-test.

Postes

Pairs

Agent microbien

Serratia marcescens

Agent antimicrobien

Eau de Javel 3 % (V/V)

 

Postes

Impairs

Agent microbien

Serratia marcescens

Agent antimicrobien

Détergent/désinfectant Amphospray ® à 5 %

 

En utilisant une ligne d'une microplaque par élève (une plaque par binôme) réaliser la procédure suivante :

Puits

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Bouillon MH (µL)

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Eau de Javel ou Amphospray (µL)

0

100

100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Jeter
100 µL

 

Redistribuer Javel ou détergent (µL)

/

/

 

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Inoculum (µ)L

100

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

 
  • Un seul cône stérile pour distribuer le bouillon MH dans tous les puits.
  • Puits 2 : jeter le cône après homogénéisation par aspiration-refoulement.
  • Puits 3 à 12 : homogénéiser en évitant la formation de bulles puis changer de cône.
  • Ajout de l'inoculum : en partant du puits 12, SAUF le puits 2
  • Recouvrir les lignes utilisées de la microplaque avec du Parafilm®.
  • Mettre les microplaques sous agitation douce à l'aide de l'agitateur orbital, 36 h RT.

 

 

 

Exemple de résultat :

Efficacite dilution amphospray

 

  1.  Argumenter sur le rôle des puits 1 et 2.
  2. Analyser après incubation les puits 1 et 2. Conclure
  3. Rédiger un tableau de résultats comprenant :
    - le % de chaque agent antibactérien pour chaque puits (calcul exigé pour tube 3)
    - la présence (+) ou absence (-) de trouble après incubation.
  4. En déduire le pourcentage minimal inhibiteur (PMI) de chaque agent microbien pour chaque micro-organisme testé. Justifier la réponse.
  5. Comparer les PMI et déterminer quel est l'agent antimicrobien le plus efficace, la souche la plus sensible (et la plus résistante) à la Javel et au détergent/désinfectant.

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Date de dernière mise à jour : 06/04/2018