Les enzymes dans le diagnostic médical

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Pour rechercher une pathologie, des tests enzymatiques sont fréquemment pratiqués dans les laboratoires d’analyses médicales. La plupart des ces tests sont réalisés sur des prélèvements sanguins.  On peut alors doser soit un substrat, soit une activité enzymatique.

En effet, lors d’une souffrance cellulaire, des enzymes habituellement intracellulaires peuvent se retrouver libres dans le plasma à de fortes concentrations. L’aide au diagnostic est donc souvent facilitée par la connaissance de la provenance de l’enzyme retrouvée en quantité anormale. Le tableau suivant en fournit quelques exemples :

Enzyme

Source

Alanine aminotransférase (ALAT)

foie

Amylase

Glandes salivaires, pancréas

Aspartate aminotransférase (ASAT)

Cœur, muscle squelettique

Créatine kinase (CK)

Muscle, cœur, cerveau

Phosphatase acide (PAC)

Prostate

Phosphatase alcaline (PAL)

Muqueuse intestinale, rein, os

 

Le tissu malade peut être aussi identifié par la détermination du profil d’isoenzymes.
[D’après l’ouvrage : Enzymologie et applications de Jean-Pierre SINE (édition ellipses 2010)]

 

1ère partie : dosage du cholestérol plasmatique 

Le cholestérol plasmatique est dosé à l'aide d'un kit fabriqué par Biomérieux (kit "Cholestérol RTU) après réalisation d'une gamme d'étalonnage de concentration croissante en cholestérol.

Dosage cholesterol 1 principe

- Indiquer, en justifiant, quelle est : la réaction principale ; la réaction indicatrice ; la réaction intermédiaire (si il y en a une)

 

La méthode mise en oeuvre est une méthode en point final : on attend la fin de la réaction ( au bout de 15 minutes : tout le substrat consommé).
Le substrat doit donc être en concentration limitante, tous les autres constituants (enzymes, coenzymes, cofacteurs) devant être en large excès avec des conditions physico-chimiques (température, pH) constants et proches des optimaux

Etalonnage de la prodécure : dosage du cholestérol plasmatique par méthode enzymatique en point final

Dosage cholesterol 1 gamme

 

L'échantillon à analyser est testé en double essai ; la détermination de la concentration en cholestérol dans le plasma peut être déterminée :

  • soit par report graphique
  • soit par le calcul en utilisant les paramètres de la droite (pente, ici en L.g-1, et ordonnée à l'origine

 

Données :
- le plasma testé a été dilué 20 fois,
- les valeurs d'absorbance mesurées pour les deux essais sont respectivement de 0,199 et 0,202,
- l'écart-type de répétabilité : sr = 0,06 g.L-1
- l'incertitude-type composée : uc = 0,09 g.L-1

1) Démontrer que ρ(cholestérol ; plasma) en g.L-1 est égale à 2,203 g.L-1 pour l'essai 1 et 2,236 g.L-1 pour l'essai 2.

2) Montrer que les deux valeurs mesurées obtenues sont bien compatibles (cf. l'aide mémoire de métrologie).

3) En déduire la valeur retenue pour ρ(cholestérol ; plasma).

4) Calculer et exprimer l'incertitude élargie U en choisissant une valeur du facteur d'élargissement k permettant d'obtenir un niveau de confiance de 95 %
     L’incertitude élargie est arrondie de la façon suivante  :  
-  si le premier chiffre significatif est 1, 2 ou 3 : garder deux chiffres significatifs ;
-  si le premier chiffre significatif est 4 ou plus : garder un chiffre significatif.

==> l'incertitude élargie U vaut-elle 0,18 g.L-1 ou 0,2 g.L-1 ?

5) Exprimer le résultat de mesure, associant la valeur retenue de ρ(cholestérol ; plasma) et l'incertitude élargie, en respectant la règle suivante : la  valeur  retenue  du  résultat  est  arrondie  de  la  façon  suivante :  le  dernier  chiffre  significatif  doit  être  à  la  même position décimale que le dernier chiffre de l’incertitude élargie.

Resultat de mesure

6) Conclure en utilisant les données suivantes :

Dosage cholesterol 1 conclusion

 

 

2ème partie : dosage de l'Alanine Amino-Transférase

La détermination de l’activité ALAT plasmatique (ou GPT) d'un patient masculin est réalisée  par le kit « Enzyline ALAT/GPT » de BioMérieux, selon la réaction :

Dosage alat

ALAT ou GPT = transaminase glutamique pyruvique

LDH = lactate déshydrogénase

- Indiquer, en justifiant, quelle est : la réaction principale ; la réaction indicatrice ; la réaction intermédiaire (si il y en a une).

 

Pré-incuber le mélange de réactif (R1+R2) 10 min à 30°C ou 37°C en bain thermostaté

Ajuster le spectrophotomètre à zéro contre de l’air ou de l’eau distillée

introduire dans une semi-microcuve spéciale UV :

- 1 000 µL du mélange de réactif (R1+R2) préalablement incubé 10 min à 30 ou 37°C

- 150 µL d’échantillon de plasma à doser

Parafilmer, homogénéiser rapidement, déclencher le chronomètre et introduire dans le spectrophotomètre thermostaté à 30°C ou 37°C.

Attendre 1 minute.

Mesurer la variation de l’absorbance à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 3 minutes

 

La méthode mise en oeuvre est une méthode cinétique en continue car on effectue la mesure de l’absorbance sur trois minutes sans arrêter la réaction.
Ici, le substrat doit être en excès ainsi que tous les autres constituants (coenzymes, cofacteurs) à l'exception de l'enzyme à doser, qui doit être limitante.

- Expliquer pourquoi la procédure indique d'attente 1 minute avant de commencer à mesurer l'absorbance.
- Justifier, à l'aide des spectres d'absorption ci-dessous, le choix de la longueur d'onde de 340 nm

Spectre nadh

 

 Sécurité : rechercher, pour les deux protocoles à mettre en œuvre :
- un danger éventuel, sa nature,
- puis une situation exposant au danger liée à la réalisation de procédure
- proposer, si nécessaire la (les) mesure(s) de prévention adaptée(s) (collectives et individuelle) au(x) risque(s) encouru(s)

Pictogramme plasma

 

La cinétique obtenue est la suivante : 

Dosage alat cinetique

 

1) Démontrer que la pente (coefficient directeur) vaut -0,0221 min-1 puis convertir en s-1.

2) Calculer la vitessse initiale de transformation ξi en mol.s-1 selon l'équation aux grandeurs

Vitesse initiale ksi

3) Valider l'équation aux grandeurs précédente en rédigeant l'équation aux unités.

4) En déduire l’activité z(ALAT ; 150 µL de plasma)  de l’ALAT en nkat puis en U.
Données
 :  
- l’activité enzymatique (z) contenue dans le milieu réactionnel porte lamême valeur numérique que la vitesse initiale de transformation ξi (enmole.s-1) dans le milieu réactionnel et est exprimée en katal.
- 1 U est la quantité d’enzyme nécessaire pour la transformation de 1 µmol de substrat par minute.

Réponse : les calculs et conversions doivent amener aux valeurs suivantes :
z(ALAT ; 150 µL de plasma)  = 6,76 x 10-11 katals 
z(ALAT ; 150 µL de plasma)  = 4,05 x 10-3 U 

5) Déduire  la concentration d’activité catalytique b(ALAT ; plasma) en nkat.L-1 et en U L-1.
Comparer avec les valeurs usuelles et conclure.

Données : valeurs usuelles dans le sérum à 30 °C :

Hommes : 100-750 nkat.L-1 ou < à 29 U.L-1 à 30 °C ou < 40 U.L-1 à 37 °C

Femmes : 80-580 nkat.L-1 ou < à 24 U.L-1 à 30 °C ou < 33U.L-1 à 37 °C

 

Conclusion : utiliser tous les résultats pour indiquer si le patient semble souffrir souffre d’une pathologie.

 

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Date de dernière mise à jour : 12/02/2017

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