Croissance microbienne - Etalonnage de la procédure

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Avant de réaliser un suivi de croissance d'un micro-organisme, il est nécessaire, pour chaque micro-organisme étudié, d'établir un étalonnage entre l'atténuance d'une suspension microbienne et la concentration en nombre de ce micro-organisme dans la suspension.

Le principe mis en oeuvre est celui de la turbidimétrie, c.à.d. du trouble d'un milieu ; si l'appareil mis en oeuvre est un spectrophotomètre, le phénomène mis en jeu est différent ; il ne s'agit pas d'une absorption du faisceau lumineux incident mais d'une diffraction des rayons lumineux incidents par les cellules en suspension.
C'est pour cette raison qu'on utilise le terme d'atténuance (symbole D) et non d'absorbance.

 

Cette relation est effectuée en deux temps, sur trois micro-organismes différents :

  1. Escherichia coli, bacille à Gram négatif, généralement isolé
  2. Staphylococcus epidermis, coque à Gram positif, généralement en amas
  3. Saccharomyces cerevisiae, champignon unicellulaire de type levure

 

1ère partie : vérifier si l'atténuance est proportionnelle à la concentration bactérienne

Pour chaque micro-organisme testé, on réalise les étapes suivantes :

  • Dilutions de raison connue d’une culture microbienne
  • Mesure de l’atténuance à une longueur d’onde adaptée (600 ou  650 nm)
  • Tracé de la courbe : D à 650 nm = f (dilutions réalisées) 

 

 

Atténuance d’une souche bactérienne d'E. coli en concentration croissante par turbidimétrie

Attenuance limite e coli 1

 

Atténuance d’une souche bactérienne de Staphylococcus epidermidis en concentration croissante par turbidimétrie

Attenuance limite s epidermidis

 

 

Atténuance d’une souche de levure Saccharomyces cerevisiae en concentration croissante par turbidimétrie

Attenuance limite s cerevisiae

 

  • L'atténuance est-elle toujours proportionnelle à la concentration microbienne (inverse de la dilution réalisée) ?
  • A partir de quelle valeur d'absorbance la relation de proportionnalité n'est-elle plus valable ?
  • Une loi mise en oeuvre en spectrophotométrie serait-elle applicable ici ?
  • Dans quelle "dilution" (cuve) mesure-t-on l'atténuance d'une suspension pure (non diluée) ?
  • Que faut-il faire si l'atténuance mesurée d'une suspension microbienne est supérieure à l'atténuance limite précédemment déterminée ?

 

2ème partie : établir une correspondance entre l’atténuance et la concentration en nombre de micro-organismes

Pour chaque micro-organisme testé, on réalise les étapes suivantes :

  • Dilutions de raison connue d’une culture microbienne
  • Dénombrement par une méthode de référence (ensemencement dans la masse ou en surface d'un volume connu)

 

  • Déterminer jusqu'à quelle dilution décimale procéder, à partir de la préculture fournie et en eau physiologique, sachant que :
    • Une culture de 18 h :
      • d'Escherichia coli contient environ 4⋅108 bactéries.mL-1 (parfois jusqu'à 2⋅109)
      • de Staphylococcus epidermidis contient environ 4⋅108 bactéries.mL-1 
      • de Saccharomyces cerevisiae contient environ 1 à 5⋅107 levures.mL-1 
    • Le volume d'inoculum est de 0,1 mL ;
    • On peut dénombrer entre 10 et 300 colonies par gélose (sur un milieu ne comportant pas d'agent de différenciation)
    • La dilution retenue sera encadrée par une dilution plus élevée et une dilution plus faible.
    • Les dilutions successives seront étalées sur gélose puis dénombrées après culture.

 

Exemple de dénombrement obtenu :

Denombrements a utiliser

  • Procéder au dénombrement des colonies obtenues sur les milieux ensemencées à partir des dilutions en eau physiologique. Réaliser un tableau de résultats.
  • Calculer la concentration bactérienne de la culture selon la norme AFNOR 7218 (ci-dessous)
  • Établir la correspondance entre absorbance et concentration bactérienne.
  • Établir l’équation reliant l’absorbance et la concentration bactérienne.

 

Norme 7218

 

 

 

 

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Date de dernière mise à jour : 11/02/2017

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