Phosphatase alcaline & méthode par points et 2 points

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

 

1ère partie : caractérisation par bio-informatique de phosphatase alcalines

A venir

 

2ème partie : détermination des vitesses de transformation, d'activité enzymatique et de concentration d'activité catalytique (méthode cinétique par points)

La méthode cinétique par points consiste à suivre l'évolution d'une réaction enzymatique au cours du temps mais de manière discontinue.

Plutôt que de laisser la cuve contenant le mélange réaction dans le porte-cuve du spectrophotmètre (réglé à la longueur d'onde de travail et préalablement ajusté à zéro sur un blanc réactif adapté), on déclenche la réaction enzymatique dans une série de cuves (en différant chaque départ d'une minute par exemple) puis on laisse la réaction se dérouler pendant unue durée croissante.

Une fois la durée voulue écoulée, il faut stopper la réaction en cours dans chaque cuve. Il est donc essentiel de mesurer chaque durée de façon très exacte, à l'aide d'un chronographe.
La réaction est stoppée par, très souvent, l'ajout d'une solution de soude concentrée ; le changement brutal de pH provoque une dénaturation instantanée de l'enzyme, ce qui met fin à la réaction.

L’ensemble des cuves permet donc de réaliser une cinétique car entre chaque cuve, la durée de la réaction enzymatique augmente : on obtient donc la quantité de produit formé entre 0 à 40 minutes, mais de manière discontinue.

Pal cinetique par points 4

 

Pal cinetique par points 3

 

Pal cinetique par points 2

 

Remarques :

  • il est possible de déterminer la période initiale, même si des points supplémentaires auraient été bienvenus entre t=0 min et t = 8 minutes. Toutefois, l'inflexion de la courbe montre que la période initiale prend fin au bout de 20 minutes, période à délimiter en traçant la tangente à la partie linéaire de la courbe.
  • Si la concentration intiale en substrat n'est pas suffisamment importante ou si la concentration en enzyme active est trop élevée, la durée de la période initiale sera plus courte et donc la détermination de la période initiale risque d'être plous difficile.

vocabulaire :
- chonomètre : intrument qui mesure l'écoulent du temps (n'importe quelle montre donc)
- chronographe : instrument qui mesure un intervalle de temps (qui est donc l'instrument à utiliser).

A partir de la période initiale, il est possible de calculer :
- la pente en (min-1)
- la vitesse initiale de transformation ξi (en mol.s-1)
- la vitesse initiale volumique de transformation vi (en mol.L-1.s-1)
- l'activité enzymatique z de l'enzyme testée dans le volume d'enzyme testé (en katals)

Connaissant le volume total de solution d'enzyme présent dans le flacon commercial ainsi que la concentration en masse de protéines dans cette solution (qui pourrait d'ailleurs être vérifiée par un dosage selon une méthode appropriée : biuret, Folin-Lowry, BCA...), on peut calculer :
- la concentration d'activité catalytique b de la PAL dans la solution de PAL (en kat.mL-1)
- l'activité spécifique zsp de la PAL (en kat.mg-1)

Voici des exemples de valeurs calculées au terme de l'activité :

ΔA/Δt ξi z(PAL ; 0,5 mL) b(PAL ; sol PAL) zsp   vi
min-1 mol.sec-1 katals kat.mL-1 kat.mg-1 mol.L-1.sec-1
0,176 3,16E-10 3,16E-10 6,33E-10 7,91E-11   2,11E-07

 

3ème partie : détermination des vitesses de transformation, d'activité enzymatique et de concentration d'activité catalytique (méthode 2 points)

Cette méthode de dosage est la plus rapide à mettre en oeuvre puisque 2 mesurages d'absorbance à deux temps déterminés et mesurées exactement suffisent.

Les mesures sont effectué en différant le déclenchement de la réaction entre le tube 1 et le tube 2, et en stoppant la réaction dans chacun des tubes après une durée courte pour le premier tube, plus longue pour le second tube, mais au bout d'un temps qui est impérativement inclus dans la période initiale.
Cela nécessite donc de connaitre au préalable la durée de la période initiale, qui a pu être déterminée au préalable (par méthode cinétique continue ou par points).
L'avantage est la rapidité d'exécution et le faible temps de mobilisation du spectrophotomètre.

      ΔA/Δt ξi z(PAL ; O,5 mL) b(PAL ; sol PAL) zsp vi
E1 à t=2 min E2 à t=9 min   min-1 mol.sec-1 katals kat.mL-1 kat.mg-1 mol.L-1.sec-1
0,556 1,836   0,183 3,29E-10 3,29E-10 6,59E-10 8,2E-11 2,20E-07

 

Comparaison des valeurs mesurées pour les deux méthodes mises en oeuvre :
-  que peut-on constater ?
-  est-ce normal ?

 

 

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Date de dernière mise à jour : 13/12/2017

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