Etude et comparaison de peroxydases

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

1^ère partie : caractérisation par bio-informatique des peroxydases étudiées

Recueil d'informations utilisant le portail EXPASY, serveur de l'Institut suisse de bioinformatique permettant l'analyse de la séquence et de la structure des protéines. Ce serveur fonctionne en collaboration avec l'EBI (Institut européen de bio-informatique).
ExPASy produit également la base de connaissance UniProtKB/Swiss-Prot sur la séquence des protéines.

structure primaire et site actif de la peroxydase de radis blanc (acces number P80679 dans la base de donnée Uniprot.org)
l'acide aminé impliqué dans le site actif est une histidine (H) surligné en jaune)

Peroxydases site actif

Représentation de la structure tridimensionnelle de la peroxydase de radis blanc :
image reconstitué après étude par cristallographie aux rayons X, montrant également les structures secondaires (hélices alpha)

Séquence protéique au format FASTA permettant de comparer plusieurs séquences protéiques par des logiciels de comparaison de séquence en ligne

2^ème partie : procédure d'extraction des peroxydases

Extraction peroxydases

Notre centrifugeuse réfrigérée :

Disposition équilibrée des tubes coniques dans les plots :

Centrifugation en cours :

Après centrigucation (5 minutes à 5 500 tpm), on obtient un culot de débris cellulaire et un surnageant pour lequel l'activité enzymatique de la peroxydase va être testé, soir à partir d'un extrait de radis noir, soit de radis rose, ou de navet...

3^ème partie : mesures et comparaisons de l'activité enzymatique de peroxydases issues d'organismes d'organismes différents

L'activité enzymatique est suivie par méthode cinétique continue sur une durée de 3 minutes

Mesure activite enzymatique pod 1

Mesure activite enzymatique pod substrat 2

Mesures de l'activité enzymatique de trois peroxydases sur les extraits clarifiés purs (manipulation de l'année 2014)

Mesures de l'activité enzymatique de trois peroxydases sur les extraits clarifiés purs (manipulation de l'année 2015)

Peroxydases extraits bruts 2015 2

Quelle différence remarque-t-on entre les courbes de variations d'absorbance entre les mesures de l'année 2014 (substrat : gaïacol contenu dans un sirop Pulmosérum, date de péremption 12/2014) et celles de l'année 2015 (même source de substrat)
Quelle hypothèse peut-on formuler ?

Mesures de l'activité enzymatique de la peroxydase de radis noir sur des extraits dilués (manipulation de l'année 2014)

Peroxydases extraits dilues 2014 1

Exemple de calculs effectués a partir des valeurs mesurées :

Pour aller plus loin

Il serait pertinent de procéder à une purification de cette peroxydase pour obtenir une solution enrichie.

Il faut pour cela mettre en oeuvre des procédures unitaires de putification mais qui vont se succéder :
- précipitation des protéines au sulfate d'ammonium pour éliminer une partie des autres biolomécules contenues dans l'extrait clarifié,
- chromatographie (échangeuse d'ions puisque le pHi de cette péroxydase a été trouvé au cours de l'activité de bio-informatique ou par tamisage moléculaire puisque, là aussi, la masse molaire moléculaire de cette enzyme a pu être trouvée ; dans les deux cas, il convient de bien choisir le type de résine (échangeuse d'anions ou de cations, diamètres des pores des billes...).

chaque étape peut alors être soumise aux vérifications suivantes :

- dosage des protéines totales
- dosage de l'activité enzymatique et des grandeurs dérivés
- calculs de concentrations d'activité catalytique
- calculs de rendement et d'enrichissement

Commentaires (4)

1. HAMOUY DOMINIQUE | 02/07/2019

bonjour Sébastien,

pourrais-tu donner quel est la composition du tampon P. merci d'avance. ( lycee Jean Monnet Franconville 95

Sébastien Droguet | 02/07/2019

Tampon phosphate sodium pH 7.5 à 0,05 M - NaH2PO4, 2 H2O et Na2HPO4, 12 H2O ==> poudre à mettre en dessiccateur avant pesée Masse à peser pour 250 mL de tampon : m (NaH2PO4, 2 H2O) = 0,663 g m (Na2HPO4, 12 H2O) = 3,043 g Peser les poudres, les dissoudre dans un peu moins de 250 mL puis ajuster le pH à 7,5 avec la solution d’acide ou de base adaptée et compléter à 250 mL

2. Minck | 23/08/2017

Bonjour,

merci pour votre blog. Je travaille sur la peroxydase avec mes élèves de TSTL. Nous purifions l'enzyme du navet avec les moyens du bord. Je pensais utiliser le radis noir cette année mais je vais davantage m'inspirer de votre site et je vais proposer la comparaison navet, radis noir et radis rose.

Cordialement

Caroline

Sébastien Droguet | 05/09/2017

Bonsoir, cette manip est tirée de l'ouvrage Biotechnologies - éditions Casteilla, 1ère édition (une nouvelle version paraît cette année) écrit notamment par deux de mes anciennes collègues.