Dosage chimique vs enzymatique : mise en évidence de la spécificité enzymatique

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Le dosage ou la recherche de biomolécules peut être basé :
- sur des méthodes chimiques (activités de 1ère : dosage des protéines par la réaction du biuret, dosage des glucides réducteurs par le DNS)
- sur des méthodes enzymatiques (activités de 1ère : recherche des activités phosphatase et peroxydase du lait)

Les objectifs de la séance :

  • Vérifier les hypothèses émises lors de l’activité documentaire sur la specificité enzymatique, basées sur l'observation des structures moléculaires des enzymes : le DNS permet de doser tous les glucides possédant une fonction réductrice libre alors que la glucose oxydase (GOD) ne permet que le dosage du glucose (spécificitié de substrat étroite)
  • Comparer la sensibilité d’un dosage chimique avec un dosage enzymatique (nous réduirons notre approche à un système linéaire dans lequel la sortie est proportionnelle à l'entrée ; on déterminera donc la sensibilité des deux méthodes simplement en calculant la pente selon l'équation générale suivante : 
S=\frac{{\rm d}I}{{\rm d}G}
 
I : indication donnée par l'essai
G : quantité de grandeur à mesurer

Pour ce faire, l’enzyme « glucose oxydase » est utilisée pour doser différents glucides, en comparaison avec un dosage par colorimétrie avec un réactif contenant de l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS)

 

Un exemple d'application

 

1ère partie : dosage chimique des glucides réducteurs par le DNS avec une gamme étalon

  • 4 solutions de glucides ont été dosées par le DNS :
    - solution de glucose,
    - de fructose,
    - de saccharose
    - de saccharose préalablement hydrolysé
    toutes à une concentration en masse de 1,00 g.L-1
  • 2 solutions étalon ont été utilisées pour réaliser la gamme d'étalonnage : solution de glucose ou solution de fructose.

 

1. Réaliser une analyse a priori des risques liés aux procédures opératoires :

Dangers dosage dns

2. Recopier et compléter le tableau de manipulation :

Dns gamme essais

3. Expliquer comment a été déterminée la longueur d’onde de 540 nm pour ce dosage.

4. Tracer la droite d’étalonnage : Aà 540 nm contre blanc réactif = f(ρ(glucose ; tube) en g.L-1 et la valider.

5. Vérifier l’acceptabilité de mesure à l’aide de l’étalon de contrôle (attention : tenir compte de sa dilution éventuelle).

6. En déduire la concentration een masse de glucides dans chaque expérience réalisée.

7. Utiliser le logigramme pour déterminer si les valeurs mesurées sont compatibles.

Données : sr ρ(glc ; solution glucides)  = 84 mg.L-1                          Mglucose = 180 g.mol-1 

 

Voici l'extrait d'un tableur d'exploitation (image de résolution plus élevée que celle ci-dessous) de valeurs mesurées et calculées

Dosages glucides dns 1

Exercice : avec les informations fournies sur l'image précédente :

  • Calculer les paramètres pour chaque droite d'étalonnage (pente, ordonnée à l'origine, coefficient de détermination R²). 
    • ​pourquoi une valeur est-elle surlignée en jaune ?
    • quelles sont les droites d'étalonnage qui peuvent être directement validées ?
  • Commenter les indications d'absorbance relevées sur le spectrophotomètre et les concentrations en masse de glucides calculées d'après les paramètres de la droite.
  • Indiquer si chacun des glucides testé est réducteur ou non réducteur.
  • En déduire si les concentrations en masse de glucides obtenues par le dosage au DNS sont cohérentes avec la réponse précédente.
  • Justifier le choix des solutions étalons utilisées pour réaliser la gamme.
  • Comparer la sensibilité de la méthode sur la gamme de glucose et sur la gamme de fructose. Observe-t-on une différence ?

 

2ème partie : dosage par la glucose oxydase à l'aide d'un étalon

Voici un résumé annoté de la notice fournie par la société Bio Mérieux concernant le kit de dosage "Glucose RTU".

Glucose rtu 1

Glucose rtu 2

 

Lors d'un dosage enzymatique, il faut toujours se poser les questions suivantes (et y répondre bien sur !) :

  1. Que dose-t-on :
    - un substrat ?
    une activité enzymatique ?
  2. Par quelle méthode :
    - point final ?
    - cinétique continue ou par points ?
    - cinétique 2 points ?
  3. Quelle est la réaction principale (celle dans laquelle intervient le substrat) ?
  4. Quelle est la réaction indicatrice (celle qui fait apparaître ou disparaitre la molécule qui a des propriétés analytiques) ?
  5. Quelle est la réaction intermédiaire (si il y en a une) ?
  6. Quelles sont les conditions opératoires:
    - rôle de la température de pré-incubation (si elle est présente)
    - rôle de la température d'incubation,
    - pH,
    - molécules en concentration  limitantes ou en excès,
    - rôle des constituants
  7. Comment est déterminée la longueur d'onde du dosage ?

Remarque : la plupart des réponses peuvent être trouvées par la simple analyse de la notice, mais des connaissances théoriques sont évidemment indispensables pour comprendre et argumenter.

 

Rapport d'activité :

1. Montrer que l'équation proposée pour le calcul de la concentration en masse de  glucose dans l’échantillon est correcte :

Concentration avec 1 etalon

 

De gauche à droite : 
1) blanc réactif : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres eau distillée
2) étalon : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres de solution étalon de glucose à 1,00 g.L-1 (soit 5,6 mmol.L-1)
3) contrôle : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres de solution contrôle de glucose à 0,93 g.L-1 (soit 4,4 mmol.L-1)
4) essai glucose : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres de solution de glucose à doser
5) essai fructose : 1 mL glucose RTU + 10 microlitres de solution de fructose à doser

Dosage enzymatique glucose rtu 1

 

Exemples de valeurs obtenues pour ce dosage :

blanc réactif étalon glucose contrôle glucose solution de glucose à doser solution de fructose à doser
0,000 0,238 0,203 0,145 0,003

 

2. Calculer la concentration en quantité de matière de glucose dans la solution de contrôle C, en mol.L-1.
Vérifier l’exactitude de mesure de la concentration molaire en glucose dans la solution contrôle C en utilisant l'aide-mémoire de métrologie (ci-dessous)
Valider (ou non) l'exécution de la procédure dans les conditions opératoires du jour.

Données : Intervalle d’acceptabilité des mesures du contrôle : [3,8⋅10 -3 mol.L-1 ; 5,0⋅10-3  mol.L-1]

3. Calculer les concentrations en quantité de matière de glucose dans :
- la solution de fructose à doser
- la solution de glucose à doser

4. Utiliser le logigramme pour déterminer si les valeurs mesurées sont compatibles.

5. Les valeurs sont-elles conformes aux hypothèses faites en début de séance ?

6. Comparer les structures du glucose et du fructose et indiquer ce que sont ces deux molécules l’une par rapport à l’autre.

Capture
Commenter la valeur obtenue pour la solution de fructose.
Que peut-on conclure quant à la spécificité de la glucose oxydase ?
Rechercher sur internet ce qu’aurait donné ce dosage fait avec le DNS.

 

La "difficulté" consiste à calculer la concentration du glucose dans la cuve "Dosage" à l'aide :

  • de l'absorbance mesurée pour la cuve dosage
  • de l'absorbance mesurée de la cuve "Etalon"
  • de la concentration connue avec exactitude de l'étalon.

L'erreur classique est de réaliser un produit en croix, ce qui mène à une équation aux grandeurs erronée, et donc à une valeur fausse.

La démonstration (tutoriel au format .exe) pour arriver à la bonne équation est la suivante : concentration à l'aide d'un seul étalon.

Par ailleurs, lorsqu'on travaillle avec un seul étalon, il faut systématiquement aussi un étalon de contrôle interne (de concentration différente de l'étalon utilisé précédemment), utilisé comme indiqué ci-dessous (extrait du document "Aide-mémoire de métrologie") :

Verification avec un etalon

 

 

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Date de dernière mise à jour : 30/11/2017

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