Chromatographie préparative échangeuse d'ions

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

1ère activité : séparation par chromatographie échangeuse d'ion d'un mélange d'acide aminés

Contrairement à une chromatographie analytique (comme la chromatographie sur couche mince) qui ne permet que de séparer les composés d'un mélange (selon leur vitesse de migration différentielle) dans le but de les identifier, une chromatographie préparative permet en plus de les récupérer.

La chromatograpie mise en oeuvre est une chromatographie sur colonne (colonne = support) avec une résine échangeuse de cations Amberlite IRC 50 (Sigma-Aldrich), donc une chromatographie d'absorption en trois étapes (fixation - lavage - élution).

Voici la fiche descriptive que l'on peut trouver sur le site de Sigma-Aldrich concernant la résine Amberlite IRC-50 :

Amberlite irc 50

 

Soit, en résumé :

Cations

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La vidéo suivante présente une séparation d'anions sur une résine cationique :

 

L'objectif est réaliser un contrôle qualité (vérification de la composition de la solution d’une ampoule par chromatographie échange d’ions) d'une suspension buvable d'acides aminés .

Le mélange d'acides aminés étudié contient de l'acide aspartique et de la la lysine.

Les différents pKa (indication de la « constante d'acidité » ; il est utilisé pour déterminer la force d’un acide. Plus l’acide est fort, plus le pKa de l’acide est petit) des groupements ionisables des acides aminés à séparer sont présentés ci-dessous :

Lysine

pKa COOH = 2,2

pKa NH2 = 8,9

pK -(CH2)4-NH2 = 10,5

Acide aspartique

pKa COOH = 2,1

pKa NH2 = 9,8

pK -CH2-COOH = 3,9

 

1. À  l’aide de ces informations :
- construire le diagramme d’ionisation de chaque acide aminé (i.e. les formules des espèces prédominantes dans chacun des domaines de pH délimités par les pKa)
- déterminer le pHi de chaque acide aminé.

Exemple : diagramme d'ionisation de la glycine (ou gycocolle)

Diagramme ionisation glycine

 

2. À l’aide des documents fournis, indiquer si la résine Amberlite IRC-50 permet de réaliser une chromatographie échangeuse d’anions ou de cations. Justifier.

3. Déterminer la charge globale et le comportement théorique des deux acides aminés lors de leur passage dans la résine à pH 4,2.

4. Déterminer la charge globale et le comportement théorique du (ou des) acide(s) aminé(s) précédemment fixé(s) lors du passage de la solution d'élution (solution de NaOH, pH > 12).

5. Réaliser un schéma de la colonne pour les différentes étapes de la chromatographie.

6. A l’aide des procédures opératoires, réaliser une analyse a priori des risques liés à la procédure opératoire :
- danger(s) (réactif, concentration si connue, signification des pictogrammes)
- nature du risque
- situations exposantes
- voies d'exposition

- événénement dangereux
- dommages possibles
- mesures de prévention.

 

Dangers chromato dosage aa


                       

ELIMINATION DES DECHETS :

Les tampons de différents pH, la soude et les restes des différentes fractions sont éliminés dans un bidon de neutralisation.

Les réactifs à la ninhydrine et le mélange réactionnel sont éliminés dans le bidon organique non halogéné.

 

Etapes de la chromatographie :

Chromato echange ions

Chromato ions asp lys

Chromato echange ions 2b
 

2ème activité : analyse colorimétrique des fractions recueillies : révélation à la ninhydrine

Sur chaque fraction recueillie sous la colonne (5 mL par tube), on effectue un dosage colorimétrique à la ninhydrine (fiche toxicologique).

Chromato echange ions 3b

L'absorbance est mesurée contre un blanc réactif adapté ; un histogramme A à 570 nm = f(numéro du tube) permet de visualiser les fractions contenant un acide aminé.

1. Réaliser un tableau de mesures selon le modèle suivant.

Tubes

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

//

17

18

19

20

Couleur

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Intensité

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A à 570nm

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Mettre autant de signe « + » que l’intensité de la coloration est importante.

2. Justifier la composition du tube 0, ou blanc réactif, de la fiche protocole 2.

3. Tracer les diagrammes suivants :
- intensité de la couleur = f(numéro du tube)
- A mesurée à 570 nm contre blanc réactif = f(numéro du tube).

4. Analyser le diagramme d’élution.

5. En déduire dans quel(s) tube(s) se trouve la lysine et l’acide aspartique.

6. Proposer une méthode d’analyse qualitative permettant de vérifier la présence ou l’absence d’autres acides aminés non désirés dans cette préparation.

 

Exemple de présentation des valeurs mesurées (histogramme à barre)

Diagramme elution asp lys

L'analyse théorique préalable permet de prévoir quel acide aminé est présent dans les tubes 1 et 2 et quel acide aminé est présent dans le tube 11.

Notons les valeurs mesurées d'absorbance et comparons avec l'étiquettage de la solution d'acides aminés :
100 mg d'acide aspartique et 500 mg de lysine pour 100 mL.

 

Les valeurs d'absorbance sont-elles cohérentes avec la composition du mélange ?

Toutefois, on obtient parfois des résultats plus délicats à interpréter :

Diagramme elution asp lys 2

Comment peut-on :

  • expliquer l'absorbance mesurée dans les tubes 5, 6, 8, 9 et 10 ?
  • déterminer le contenu des tubes 5, 6, 8, 9 et 10 ?

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Date de dernière mise à jour : 21/03/2017

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