Comparaison de méthodes de dosage des protéines dans des milieux complexes - Électrophorèse des protéines sur gel d'agarose

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

1ère activité : comparaison de deux méthodes de dosage des protéines présentes dans des milieux complexes.

De nombreuses méthodes de dosage colorimétrique des protéines peuvent être mises en oeuvre par spectrophotométrie d’absorption(Biuret, Bradford, Folin-Lowry, BCA).
Elles sont basées sur la réaction d’agents chromophores avec les liaisons peptidiques ou avec certains acides aminés des protéines, mais elles ne peuvent pas être réalisées de façon indistincte. Il faut notamment prendre en compte :

  • la sensibilité de la méthode
  • l'interférence dues aux autres solutés présents dans la solution à doser.

Voici un tableau comparatif de ces méthodes de dosage (paragraphe 2) (Remarque : il y a une erreur dans la colonne "Biuret", ligne "Réactif" : le réactif mis en oeuvre est le Gornall, dont la coloration bleu est due aux ions cuivre II)

Deux méthodes sont comparées :

Méthode du biuret : appelée ainsi en référence avec l'analogie de la réaction se produisant avec deux molécules d'urée condensées entre elles, elle est basée sur la complexation, en milieu alcalin,,des ions cuivre II (Cu2+) avec les protéines qui possèdent au moins 4 liaisons peptidiques ; un complexe bleu-violet se forme, son intensité est proportionnelle à la concentration en protéines. 

Méthode de Bradford : elle est basée sur le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison (complexation) avec les acides aminées aromatiques (phénylalanine, tyrosine, tryptophane) et les résidus hydrophobes présents dans les protéines. Il est essentiel de réaliser le mesurage de l'absorbance des essais en même temps que la gamme.

 

1. Indiquer la composition du blanc réactif pour chaque méthode que mise en oeuvre.
Justifier cette composition.

2. Préciser les concentrations en étalon choisies pour les 6 tubes de la gamme.

3. Établir les équations aux grandeurs, aux unités et aux valeurs numériques permettant de calculer les volumes à introduire dans le premier tube de la gamme.

4. Dresser un tableau de manipulation complet pour la colorimétrie réalisée.

5. Rédiger un tableau d’analyse des risques pour la méthode mise en œuvre à partir de chaque procédure opératoire et du tableau suivant :

Dangers methodes dosage proteines 1

 

6. Tracer la courbe A…..nm = f(concentration en protéines en g.L-1) pour chaque méthode mise en oeuvre.

 

Etalonnage biuret

 

Etalonnage bradford

7. Comparaison des gammes d'étalonnage réalisées avec les deux méthodes : quelles conclusions tirer concernant la sensibilité de chaque méthode et leur seuil de détection ?
(étalon : solution d'ovalbumine)

8. A partir des valeurs mesurées d'absorbance pour chaque essai, déterminer la concentration en protéines dans les 4 milieux de culture.
Donnée : sr absorbance = 0,025

 

Les valeurs mesurées pour le dosage des protéines dans les milieux complexes étudiées sont discutées au laboratoire.
4 milieux ont été testés :

  • milieu contenant essentiellement de l'albumine
  • milieu contenant esentiellement de l'albumine + acides aminés
  • milieu contenant essentiellement de l'albumine + glucose
  • milieu contenant essentiellement de l'albumine + glucose + acides aminés

Tableau de valeurs mesurées :

Dosage bradford vs biuret

9. Analyser les résultats :

  • Indiquer si la concentration en protéines obtenue correspond à celle indiquée dans la composition des milieux de culture.
  • Indiquer quels sont les éléments contenus dans le milieu de culture qui pourraient être responsables des interférences observées ?

10. Synthèse : mise en commun des données expérimentales permettant d’effectuer la comparaison des deux méthodes de dosage des protéines dans un milieu biologique complexe :

  • Établir un tableau récapitulatif :
    • des caractéristiques des procédures (utiliser l’annexe 1 pour déterminer les constituants impliqués dans la réaction colorimétrique) ;
    • des résultats obtenus pour chaque milieu.
  • Analyser et commenter les résultats :
    • Indiquer quelle serait la méthode la plus appropriée pour doser les protéines dans un milieu complexe (milieu M4).
    • Indiquer pour quelle raison l’autre méthode testée est toujours utilisée.
  • Rechercher d'autres méthodes de dosage des protéines.
    Préciser leur spécificité.

 

2ème activité : séparation et identification de protéines par électrophorèse sur gel d’agarose

Après :

  • préparation d'un gel d'agarose à 1 % (m/V) ;
  • préparation des solutions de dépôt : solutions étalon d'ovalbumine, de caséine, de lysozyme et de différents milieux biologiques complété avec du tampon de charge (bleu de bromophénol pour suivre la migration et saccharose ou glycérol comme alourdisseur) : voir photo
  • électrophorèse à voltage constant pendant 1h en tampon TBE (Tris Borate EDTA) pH 8,6 : voir photo
  • révélation des protéines:
    • au rouge Ponceau ;
    • au bleu de Coomassie, qui se fixe, par des liaisons faibles, aux acides aromatiques (phénylalanine, tyrosine, tryoptophane)

Comparaison de deux méthodes de révélation des protéines : au rouge Ponceau et au bleu de Coomassie : quelle conclusion tirer ?

Ponceau vs coomassie

  • Le rouge Ponceau est peu sensible, il se décolore avec le temps, n'est pas facile à photographier (le contraste entre les bandes colorées et le reste du gel est difficile à photogaphier, sauf si l'on dispose d'un Imager) iues de captage d'image (caméras ou "scanner"). 
  • le bleu de Coomassie est plus sensible,  la coloration est irréversible. 

 

Electrophorégramme après révélation au bleu de Coomassie

Remarque : la qualité réelle est supérieure au rendu photo ; une image de qualité nécessite un "imager", scanner spécialisé dans la numérisation des gels d'électrophorèse, comme ce modèle qui équipera prochainement notre laboratoire.

Electrophorese revelation paillot m 5

 

Edit mai 2016 : le scanner de gel étant arrivé, le gel, conservé depuis le mois d'octobre (soit 8 mois) à 4 °C, emballé dans du film cellophane et imprégné de tampon TBE 1X, a été scanné :

Electrophorese proteines agarose 2 1

Légendes des dépôts :

  1. solution étalon d'ovalbumine
  2. solution étalon de lysozyme
  3. solution étalon de caséine
  4. blanc d'oeuf
  5. salive
  6. cachet de Maxilase préalablement dissout
  7. lait UHT écrémé
  8. blanc d'oeuf dilué au 1/10
  9. solution étalon d'ovalbumine
  10. solution étalon de lysozyme

 

Quelles conclusions tirer :

  • concernant la composition qualitative des milieux biologiques testés (salive, blanc d'oeuf, lait UHT) ?
  • concernant la charge globale, et donc le pHi (pH pour lequel une molécule est sous forme d'ion mixte ou swittertion) comparé au pH du tampon), de chaque protéine étalon ?

 

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Date de dernière mise à jour : 11/02/2017

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