Comparaison de méthodes de dosage des protéines dans des milieux complexes

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

Comparaison de deux méthodes de dosage des protéines présentes dans des milieux complexes.

De nombreuses méthodes de dosage colorimétrique des protéines peuvent être mises en oeuvre par spectrophotométrie d’absorption (Biuret, Bradford, Folin-Lowry, BCA).
Elles sont basées sur la réaction d’agents chromophores avec les liaisons peptidiques ou avec certains acides aminés des protéines, mais elles ne peuvent pas être réalisées de façon indistincte.
Il faut notamment prendre en compte :

  • la sensibilité de la méthode ;
  • l'interférence dues aux autres solutés présents dans la solution à doser.

Voici un tableau comparatif de ces méthodes de dosage (paragraphe 2) (Remarque : il y a une erreur dans la colonne "Biuret", ligne "Réactif" : le réactif mis en oeuvre est le Gornall, dont la coloration bleu est due aux ions cuivre II)

Deux méthodes sont comparées :

Méthode du biuret : appelée ainsi en référence avec l'analogie de la réaction se produisant avec deux molécules d'urée condensées entre elles, elle est basée sur la complexation, en milieu alcalin, des ions cuivre II (Cu2+) avec les protéines qui possèdent au moins 4 liaisons peptidiques ; un complexe bleu-violet se forme, son intensité est proportionnelle à la concentration en protéines. 

Méthode de Bradford : elle est basée sur le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison (complexation) avec les acides aminées aromatiques (phénylalanine, tyrosine, tryptophane) et les résidus hydrophobes présents dans les protéines. Il est essentiel de réaliser le mesurage de l'absorbance des essais en même temps que la gamme.

 

FICHE TECHNIQUE 1

Dosage colorimétrique des protéines par la méthode de Bradford

Principe

En milieu acide, la forme anionique du bleu de Coomassie G250 interagit (par des liaisons non covalente = adsorption) avec les radicaux aromatiques des acides aminés constitutifs des protéines. Sa longueur d'onde maximale d'absorption augmente alors de 465 nm (rouge) à 595 nm (bleu).

Gamme d’étalonnage de la procédure

À partir d'une solution étalon de protéine (SAB) à 250 µg.mL-1 préparer en respectant ces conditions :

  • 4 solutions étalon filles de concentration : 50 – 100 – 150 - 200 µg.mL-1
  • Sous un volume final de 1 mL, en utilisant de l'eau physiologique comme diluant.

Réalisation de la gamme

Traiter chacun des 5 étalons selon le mode opératoire présenté ci-après.

  • Introduire dans une cuve de spectrophotomètre :

Solution étalon à doser

0,100 mL

Réactif au bleu de Coomassie (en dispensette)

2 mL

Parafilmer et homogénéiser.

Attendre 5 min à l'obscurité.
Homogénéiser. Essuyer les parois de la cuve au papier Joseph

Lire les absorbances à _______ nm contre un blanc réactif adapté

Stabilité de la coloration : 30 min

Limite (théorique) de linéarité : 0,15 g.L-1

  • Prévoir la composition du blanc réactif.

 

Dosage des protéines dans les milieux 

  • 1 essai sera réalisé par milieu à partir de chaque milieu préalablement dilué au 1/100 en même temps que la gamme.
  • Un contrôle sera réalisé dans les mêmes conditions opératoires avec la solution SC1 :
    ρ (protéine ; solution SC1) = 200 µg.mL-1

Inconvénients 

  • Méthode linéaire sur un intervalle étroit (2 µg.mL-1 à 120 µg.mL-1) ce qui rend nécessaire des dilutions préliminaires de l'échantillon tissulaire avant analyse.
  • Les acides aminés, les peptides et les protéines de bas poids moléculaire (< 3 000 Da ; 1 dalton Da correspond à la masse molaire d’un atome d’hydrogène soit 1 g.mol-1) ne sont pas détectés par cette méthode.
  • Dosage influencé par les bases fortes, les détergents, les lipides et les acides nucléiques.

 

 

FICHE TECHNIQUE 2

Dosage colorimétrique des protéines par la méthode du biuret

Principe

Les ions Cu2+ (ajoutés sous forme de sulfate de cuivre) se lient aux atomes d'azote des liaisons peptidiques de la protéine dans des conditions de pH alcalin, produisant ainsi un complexe mauve avec absorption maximale à 540-550 nm.

Gamme d’étalonnage de la procédure 

À partir d'une solution étalon de protéine (SAB) à 10,0 g.L-1 préparer en respectant ces conditions :

  • 4 solutions étalon filles de concentration : 2,0 – 4,0 – 6,0 – 8,0 g.L-1
  • Sous un volume final de 1 mL, en utilisant de l'eau physiologique comme diluant.

Mode opératoire 

Traiter chacun des 5 étalons selon le mode opératoire présenté ci-après.

  • Introduire dans une cuve de spectrophotomètre :

Solution étalon à doser

0,5 mL

Réactif de Gornall (en dispensette)

2 mL

Parafilmer et homogénéiser.

Attendre 30 min à l'obscurité, à température ambiante.

Homogénéiser. Essuyer les parois de la cuve au papier Joseph

Lire les absorbances à ______ nm contre un blanc réactif adapté.

Stabilité de la coloration : 30 min

Limite de linéarité : 10 g.L-1

  • Prévoir la composition du blanc réactif.

Dosage des protéines dans les milieux

  • 1 essai sera réalisé par milieu à partir de chaque milieu préalablement dilué au ½ en même temps que la gamme.
  • Un contrôle sera réalisé dans les mêmes conditions opératoires avec la solution SC2 :
    ρ(protéine ; solution SC2) = 5,0 g.L-1

Inconvénients 

  • Méthode nécessitant au moins 3 ou 4 liaisons peptidiques. Les dipeptides et tripeptides ne peuvent être dosés.
  • Dosage influencé par divers solurés
    • L'ammoniac et certaines amines peuvent interférer (tampon TRIS, sels de sulfate d'ammonium).
    • Le réactif de Gornall contient du cuivre qui va révéler le glucose (comme la liqueur de Fehling) si celui-ci est présent ; le glucose va interférer avec le dosage

 

1. Indiquer la composition qualtitative et quantitative du blanc réactif pour chaque méthode que mise en oeuvre.
Justifier cette composition.

2. Etablir le modèle de mesure, l'équation aux grandeurs, l'équation aux unités permettant de calculer le volume de solution étalon à introduire dans chaque tube de la gamme.

3. Établir les équations aux valeurs numériques permettant de calculer les volumes à introduire dans chaque tube de la gamme.

4. Dresser un tableau de manipulation complet pour la colorimétrie réalisée.

5. Rédiger un tableau d’analyse des risques pour la méthode mise en œuvre à partir de chaque procédure opératoire et du tableau suivant :

Dangers methodes dosage proteines 1

 

6. Tracer le nuage de points : A…..nm = f(concentration en masse en protéines en g.L-1) pour chaque méthode mise en oeuvre. 
Légender les axes et faire apparaître sur le tableur l’équation de la droite obtenue ainsi que le coefficient de détermination R².

Exemples de valeurs et de graphiques obtenus : (compléter le titre, sous-titre (la fonction mahtématique de la droite) et les légendes des axes)

Gamme d'étalonnage et essais obtenus pour la méthode du Biuret :

    Gamme d'étalonnage
ρ(ovalbumine ; tube) en g.L-1   0 2 4 6 8 10
Absorbance à ……… nm   0,000 0,104 0,194 0,295 0,382 0,481

 

Photo de la gamme (à venir) : 

 

    Eessais et solution contrôle
Solutions   M1 au 1/2 M2 au 1/2 M3 au 1/2 M4 au 1/2 Sol. Contrôle  
Absorbance à ……… nm   0,204 0,240 0,225 0,246 0,260  

 

Gamme biuret a completer

 

Gamme d'étalonnage et essais obtenus pour la méthode de Bradford :

    Gamme d'étalonnage
ρ(ovalb ; tube) en µg.mL-1   0 50 100 150 200 250
Absorbance à ……… nm   0,000 0,053 0,117 0,176 0,235 0,283

 

Photo de la gamme (à venir) : 

 

    Eessais et solution contrôle
Solutions   M1 au 1/2 M2 au 1/2 M3 au 1/2 M4 au 1/2 Sol. Contrôle  
Absorbance à ……… nm   0,074 0,062 0,080 0,095 0,184

Gamme bradford a completer

Remarque : rechercher la limite de linéarité dans la fiche technique. Est-elle confirmée ou infirmée par cette expérience ?

7.  Vérification de la bonne exécution de la procédure : utiliser l’équation de la droite d’étalonnage précédemment tracée pour déduire la concentration en masse de protéine dans la solution de contrôle utilisée.
Comparer la valeur obtenue avec les données ci-dessous et conclure sur la validité de la série de mesure
(utiliser l'aide-mémoire de métrologie, paragraphe "Vérification de l’exactitude de mesure à l’aide d’un étalon de contrôle").

Données pour l'exploitation du contrôle :
- méthode de Bradford :       Liminf = 185 µg.mL-1             Limsup = 215 µg.mL-1
- méthode du biuret :            Liminf = 4,625 g.L-1                  Limsup = 5,375 g.L-1

8. Utiliser l’équation de la droite d’étalonnage précédemment tracée pour déduire la concentration en masse de protéine dans chacun des milieux testés (présenter sous forme de tableau)

9.  Exprimer chaque résultat conformément aux règles de métrologie (en rajoutant une ligne au tableau)

Données pour l'expression du résultat de mesure (rappel : résultat = valeur mesurée ± incertitude élargie) :
- méthode de Bradford :     uc = 60 µg.mL-1 avec un facteur d'élargissement k = 2
- méthode du biuret :          uc = 0,09 g.L-1 avec un facteur d'élargissement k = 2

10. Comparaison des gammes d'étalonnage réalisées avec les deux méthodes : quelles conclusions tirer concernant la sensibilité de chaque méthode et leur seuil de détection ?
(étalon : solution d'ovalbumine)

 

Les valeurs mesurées pour le dosage des protéines dans les milieux complexes étudiées sont discutées au laboratoire.

4 milieux ont été testés :

  • milieu contenant essentiellement de l'albumine
  • milieu contenant esentiellement de l'albumine + acides aminés
  • milieu contenant essentiellement de l'albumine + glucose
  • milieu contenant essentiellement de l'albumine + glucose + acides aminés

Tableau de valeurs mesurées obtenues par les élèves ayant mise en oeuvre la méthode du Biuret

Dosage biuret

L'écart-type (étudié en Mesure-Instrumentaiton en classe de Première) et le coefficient de variation sont des paramètres indiquant la dispersion des valeurs mesurées.
- l'écart-type possède la même unité que la valeur mesurée (donc ici des g.L-1)
- le coefficient de variation (ou écart-type relatif, qui est le rapport de l'écart-type à la moyenne) est ici exprimé en poucentage. 

Plus la valeur de ces paramètres est élevée, plus la dispersion autour de la moyenne est grande.

 

Tableau de valeurs mesurées obtenues par les élèves ayant mise en oeuvre la méthode de Bradford

Dosage bradford 1

 

11. Analyser les valeurs obtenues :

  • Indiquer si la concentration en protéines obtenue correspond à celle indiquée dans la composition des milieux de culture.
  • Comparer avec les données fournies dans les fiches techniques concernant d'éventuelles interférences. Sont-elles vérifiées ? Si non, proposer une ou plusieurs hypothèses.

12. Synthèse : mise en commun des données expérimentales permettant d’effectuer la comparaison des deux méthodes de dosage des protéines dans un milieu biologique complexe :

  • Établir un tableau récapitulatif :
    • des caractéristiques des procédures
    • des résultats obtenus pour chaque milieu.
  • Analyser et commenter les résultats :
    • Indiquer quelle serait la méthode la plus appropriée pour doser les protéines dans un milieu complexe (milieu M4).
    • Indiquer pour quelle raison l’autre méthode testée est toujours utilisée.
  • Rechercher d'autres méthodes de dosage des protéines.
    Préciser leur spécificité.

 

Aller plus loin :

  • Rechercher d'autres méthodes de dosage des protéines.
  • Préciser leur spécificité.

 

 

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Date de dernière mise à jour : 13/09/2017

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