Propriétés des acides nucléiques

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudié. Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Les objectifs sont :

  • D'étudier expérimentalement les propriétés spectrales particulières des acides nucléiques, liées à leur structure et composition.
  • De quantifier avec exactitude et rapidité la concentration en masse rho(ADN ; solution) d'ADN en solution. La spectrophotométrie est le plus souvent utilisée car elle présente l’avantage de ne pas détruire l’échantillon. Celui-ci peut alors être récupéré pour d’autres analyses et manipulations.

 

1ère partie : choix des cuves de mesures adaptée au mesurage dans le bas UV
 

Cuves mesures choix

Cuves mesures spectro 2

 

Réalisation, sur le même spectrophotomètre UV1600 PC et avec le logiciel MWave les spectres d'absorption des cuves de mesures spectrophotométriques disponibles au laboratoire, dans le domaine de l'ultra-violet, en mode automatique (ajustage à zéro contre de l'air : porte-cuve vide) :

Spectres cuves comparaison

1. Présenter le document numérique regroupant l'ensemble des spectres réalisés.

2. Analyser et comparer les spectres d'absorption des cuves testées.

3. En déduire quelles sont la/les cuve(s) les plus adaptées à un dosage d'une molécule dans le domaine 200-300 nm.

4. Résumer trois critères de qualité d'une cuve dédiée à cet usage.

 

Remarque : deux instruments de mesure identiques (ici nos deux spectrophotomètres UV1600 PC) rendent toujours des valeurs mesurées différentes ; bien visible ici sur les spectres d'absorption de 4 cuves (chaque spectre ayant été réalisé sur les deux appareils avec exactement la même cuve) :

Spectres cuves spectro uv1600pc1

Spectres cuves spectro uv1600pc2

 

 

2ème partie : choix de la longueur d'onde optimale pour le mesurage de l’ADN en solution 

Réalisation, sur le même spectrophotomètre,dans le domaine 220-300 nm, en utilisant la cuve de mesure adaptée, des spectres d'absorption des solutions suivantes :

  • Solution "S" d’ADN de sperme de saumon de concentration inconnue (500 µL par cuve)
  • Solution de protéine pure (Sérum-Albumine Bovine SAB) (500 µL par cuve)

Spectres adn et proteines

 

1. Indiquer la composition du tube zéro permettant d’ajuster le spectrophotomètre avant la mesure de l’absorbance des solutions.

2. Présenter le document numérique regroupant les deux spectres réalisés.

3. Analyser et comparer les spectres d'absorption des solutions d'ADN et de protéine  : déterminer, à l’aide de ces spectres, la longueur d’onde optimale d’absorption :
- d’une solution pure d’ADN ;
- d’une solution pure de protéine.

 

3ème partie : analyse qualitative d'une solution d'ADN par spectrophotométrie

1. Estimer, à l'aide des mesures précédentes, la pureté d'une solution d'ADN fournie :
- vis-à-vis des protéines ;
- vis-à-vis des molécules organiques.

2. Valider l’absence d’impuretés dans la solution.

Purete adn rapports absorbance

 

4ème partie : analyse quantitative d'une solution d'ADN par spectrophotométrie

1. Ecrire, à l'aide des informations suivantes, la relation (basée sur la loi de Beer-Lambert, non exigée ici) entre l’absorbance d’une solution d’ADN bicaténaire et sa concentration.

Acide nucléique

Coefficient d'absorption linéique molaire

en mLμg -1cm-1

Concentration en masse correspondant à une unité d’absorbance

ADN bicaténaire

0.020

rADNdb = 50 µg.mL-1

ARN monocaténaire

0.025

rARNsb = 40 µg.mL-1

 

2. En déduire la relation lorsqu’on travaille sur une solution diluée d’ADN.

3. Calculer rho(ADN ; solution S) à partir de la valeur d'absorbance relevée sur le spectre.

 

5ème partie : étude de l'effet de la chaleur sur une solution d'ADN par spectrophotométrie

Voici une série de mesurages d'absorbances :

Sample Name Abs. (260nm)
1 (25 °C) 0,188
2 (25 °C) 0,194
3 (25 °C) 0,200
4 (25 °c) 0,360
   
1 (80 °C) 0,247
2 (80 °C) 0,234
3 (80 °C) 0,268
4 (80 °c) 0,386

 

1. Analyser et comparer ces valeurs. Proposer une explication, en se basant sur les propriétés connues des nucléotides.

 

Une série de mesure d'absorbance à 260 nm (contre un blanc réactif adapté) d'une solution d'ADN chauffé à différentes températures a permis de construire le graphique suivant :

 

Effet hyperchrome 2

2. Analyser ce graphe.

3. Utiliser la méthode des tangentes pour déterminer la température à laquelle la moitié des molécules d'ADN est dénaturée ( température de fusion ou Tm).

 

Construire une synthèse de l'ensembles des conclusions obtenues

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Date de dernière mise à jour : 11/02/2017

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