Electrophorèse des protéines

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudiée.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

Une analyse sanguine comprend de nombreux examens et paramètres :

  • L’hémogramme ou Numération de la Formule Sanguine (NFS) : numération des hématies, plaquettes et leucocytes (cf. AT de première : Frottis sanguin et formule leucocytaire), hématocrite, taux d’hémoglobine.
  • Le bilan lipidique : taux de triglycérides, de cholestérol… (cf. AT de terminale : Les enzymes dans le diagnostic médical).
  • Le bilan glycémique : glycémie à jeun  (cf.AT de terminale : Dosage chimique vs enzymatique : mise en évidence de la spécificité enzymatique).
  • Le bilan de la fonction rénale : dosage de la créatine et de l’urée dans le plasma.
  • le bilan hépatique : dosage d’enzymes sanguines (cf. AT de terminale : Les enzymes dans le diagnostic médical).
  • Le bilan de la coagulation sanguine.
  • Un dosage colorimétrique des protéines (cf. AT de première : Dosage des protéines par la méthode du biuret).
  • Une analyse semi-quantitative par comparaison des différentes classes de protéines après électrophorèse : rechnique d’analyse et de fractionnement basée sur la migration différentielle de molécules chargées (ions, macromolécules, particules) sous l’action d’un champ électrique. Chaque molécule se déplace à une vitesse qui lui est propre, vers le pôle de signe opposé à sa charge

Ces examens permettent de déceler ou diagnostiquer de nombreuses pathologies

  • L'objectif est de réaliser une séparation électrophorétique des protéines sériques suivi d'une analyse numérique afin d'établir le profil électrophorétique du sérum d'un patient.

 

Composition du sérum humain en protéine
La protidémie ou protéinémie (concentration en protéines dans le sang) usuelle varie de 65 à 80 g.L-1.
Les protéines du plasma sont classées en deux fractions :

  • La sérum-albumine : elle intervient dans la pression osmotique plasmatique, lors du transport des acides gras, des médicaments, des hormones thyroïdiennes…
  • Les globulines : sont elles-mêmes réparties en trois groupes :
    - les α-globulines (ex : l’α2 macroglobuline) pour la plupart impliquées dans le processus inflammatoire qui est une réaction de défense.
    - les β-globulines (ex : le fibrinogène, protéine globulaire se transformant en protéine fibreuse nommée fibrine au cours du phénomène de coagulation).
    - les γ-globulines : ce sont les immunoglobulines M, G, D, E et A, également appelés anticorps.

Ces protéines ont les caractéristiques présentées ci-dessous :

Protéines

Sérum albumine

α-1 globuline

α-2 globuline

β globuline

γ globuline

pHi[1]

4,9

5,3

5,4

5,6

5,8 à 7,3

Concentration usuelle dans le sérum (en g.L-1)

41,9

2,5

6,5

9,0

12,1

Pourcentage usuel

 

 

 

 

 

Charge globale à pH 8,6           

[1] Le pHi (ou pH isoélectrique) est le pH pour lequel une molécule possédant des fonctions ionisées ne migre pas dans un champ électrique.
-Lorsque le pH du milieu est inférieur au pHi de la molécule, celle-ci est chargée positivement.
-Lorsque le pH du milieu est supérieur au pHi de la molécule, celle-ci est chargée négativement.
(cf. CBSV ; diagramme d’ionisation des acides aminés)

À l’aide des informations précédentes :

  • Relever les noms et rôles des protéines sériques.
  • Calculer le pourcentage  de chaque classe de protéines par rapport aux protéines sériques totales.
  • Indiquer quelle sera la charge électrique de chaque classe de protéine dans une solution tampon à pH 8,6. Argumener la réponse.
  • En déduire à quel endroit doit être déposé le sérum sur la bande d'acétate de cellulose : (côté pole négatif ou cathode, centre, ou côté pole positif ou anode ?
    (cf. fiche technique "Réaliser une électrophorèse de protéines sur acétate").
  • Prévoir, à l’aide de la fiche technique et des informations précédentes, le sens et l’ordre de migration des différentes protéines du sérum sachant que :
    une protéine est d’autant plus chargée que le pH du milieu est éloigné du pHi de la protéine
    plus une protéine est chargée, plus elle se déplacera rapidement dans un champ électrique.

 

L'électrophorèse se fait à partir d'un sérum humain : Différence entre sérum et plasma.
A partir de ce document :

  • Indiquer toutes les étapes nécessaires à l'obtention :
    - d'un sérum humain
    - d'un plasma humain
  • Rédiger une analyse des risques liées à la manipulation du sang : danger, nature du risque, voies d'exposition, situations exposantes au danger, événement dangereux, mesures de prévention collectives et individuelles

Remarque ; l'intégralité de cette manipulation est réalisée en démonstration par l'enseignant.

 

Parmi les supports utilisés pour l'électrophorèse, on trouve :
- le papier (séparation de petites molécules comme les acides aminés) 
- l’acétate de cellulose (séparation des protéines)  : support utilisé pour cette activité
- les milieux gélifiés comme l’agarose, l’amidon… (séparation plus grossière pour les grandes molécules d’ADN et les protéines ou lipoprotéines
- les gels de polyacrylamide et de polyvinyle (séparation très fine de protéines et d’acides nucléiques).

Voici une vidéo une électrophorèse des protéines sériques dans le cadre d'une analyse médicale :

 

Le schéma du montage, avc comme support une bande d'acétate de cellulose, est le suivant :

Electrophorese montager

Le montage est identique à celui présenté sur cette page.

D'autres montages sont possibles, en fonction du support :

Electrophorese agarose vs polyacrylamide

Les échantillons soumis à électrophorèse sont incolores. C’est pourquoi l’électrophorégramme doit être coloré à l’issue de la migration. Le colorant ne dépend pas de la technique utilisée, mais de la nature des échantillons à analyser :
- les protéines peuvent être révélées par le rouge Ponceau ou le bleu de Coomassie
- l’ADN peut être révélé par des agents intercalants comme le SYBR Green ou le GelRed.

 

Voici le protéinigramme obtenu, avant transparisation (photographie prise avec un smartphone, non traitée, puis après une retouche photo)

Elec prot 2015 1

Elec serumt 2017 5

Elec prot seriques avant apres transparisation

Réaliser un densitogramme à partir de l'électrophorégramme en utilisant le tutoriel "MESURIM sur protéinogramme"

Créer un document numérique renfermant, sur une seule page :
- l’électrophorégramme
- le densitogramme obtenu après traitement 
Pour ce faire, réaliser des copies écran, les coller sur un document texte en respectant les proportions (touche shift maintenue lors du redimensionnement de l'image) et en alignant les deux images l'une au-dessus de l'autre?
Imprimer un document comportant le densitogramme et.

Identifier sur chacun des deux documents les protéines sériques.

Utiliser les valeurs du densitogramme pour comparer le pourcentage en protéines du sérum analysé avec les valeurs classiquement trouvées chez les sujets sains.

Indiquer si le sérum analysé présente une pathologie liée à un déséquilibre protéique.    

 

Exemple de protéinogramme de meilleure qualité (source : Jeulin)

Electrophorese proteines acetate jeulin

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Date de dernière mise à jour : 23/05/2017

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