Etude d'un bio-insecticide

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudiée.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

Les bio-insecticides sont des moyens de lutte biologique. Ce sont des insecticides préparés à partir d’organismes vivants ou de leurs produits.

Insecticide biologique

L’objectif est :

  • d'aborder l'étude de bactéries caapables de former une structure particulière (l'endospore) en effectuant une comparaison avec une souche de référence non sporulante Gram (négative).
  • de caractériser et d’identifier la bactérie utilisée comme insecticide biologique. 

 

1ère partie : orientation et identification (effectué en partie sous forme d'exercice permettant de réviser les notions des AT précédentes)

1. Voici les observations microscopiques d'un élève : cellules en forme de bâtonnet de 4 à 6 µm de long et environ 1, 5 de large,  avec une zone blanche sphérique au centre de la cellule qui conserve sa forme de bâtonnet, se déplaçant selon un mouvement lent, sinueux, désordonné.
- interpréter ces observations
- compléter la description à l'aide du document

2. Un isolement a été effectué à partir de la suspension du micro-organisme à identifier, incubé 36 h à 37 °C sur gélose TSA en grande boite de Pétri :

Microcinématographie montrant la croissance d'une colonie sur milieu gélosé 

Capture 1

(Crédit : https://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tamop412A/2011-0073_practical_microbiology/ch11s03.html)

  • Indiquer le rôle de chacun des constituants de la gélose TSA (document 1).
  • En déduire si la gélose trypticase soja :
    • est un milieu sélectif ou non sélectif. Justifier la réponse.
    • est un milieu d’orientation ou non. Justifier la réponse.
    • est un milieu synthétique ou empirique. Justifier la réponse.
  • interpréter le résultat de l'isolement.

3. Un test enzymatique de discrimination rapide est réalisé : une colonie est prélevée est dissociée dans une goutte d'eau oxygénée (H202) préalablement déposée sur une lame.
Le résultat est le suivant :

Test orientation

  • citer le nom du test mis en œuvre ;
  • justifier le choix de la réalisation de ce test ;
  • Interpréter le résultat du test (photo) ;
  • conclure.

4. Un milieu Viande-Foie a été ensemencé et incubé 24 h à 37 °C :

  • indiquer le rôle de ce milieu ;
  • Interpréter le résultat ;
  • Conclure.

Vf a interpreter

 

5. Un bouillon hypersalé (7% (m/V) de NaCl ) a été ensemencé et incubé 24 h à 37 °C.
Le milieu est devenu trouble.

Interpréter ce résultat.

 

6.  Une gélose à l'amidon a été ensemencée et du lugol (eau iodée) ajouté après culture.
Le résultat suivant est le suivant :

À l'aide du document 3 :

  • Interpréter le résultat.
  • Conclure.

Gelose a l amidon a interpreter

 

6. Utiliser les résultats obtenus et le document 4 pour orienter l’identification de la bactérie par raisonnement dichotomique, en argumentant la réponse.

7. Utiliser les résultats obtenus et le document 5 pour identifier la bactérie par raisonnement dichotomique, en argumentant la réponse.

Afin de valider la capacité à réaliser une coloration de Gram correcte, deux frottis seront réalisés sur une seule et même lame (avec séparation nette des deux frottis évidemment) : ceci garantit que la coloration sera strictement la même pour chaque type de cellule

  • Souche de référence : bactérie à Gram négatif  :

Serratia

  • La bactérie utilisée comme bio-insecticide

Spores bacillus cereus 1

 

Une coloration des spores au vert de Malachite a froid (solution à 110 g/L) est également réalisée (Gt = 1 000 fois)

Img 20180412 121941

Img 20180412 121944

 

Etude réalisée dans le cadre d'un PTA : mise en évidence des cristaux de la toxine protéique de cette bactérie:

Bt toxines et sporanges

Cristaux toxine bt 6


 

DOCUMENT 1

Gélose Trypticase-Soja-Agar (TSA) - Extraits de la fiche Biomérieux ®

La gélose Trypcase Soja est un milieu d’isolement destiné au développement des germes qui ne présentent pas d’exigences particulières pour leur développement.

COMPOSITION  (Formule théorique pour 1 L, pH final 7,3)

Peptone de caséine (bovin) ...............................................................15 g

Peptone de soja....................................................................................5 g

Chlorure de sodium.............................................................................5 g

Agar .............................................................................................. .....15 g

 

 

DOCUMENT 2 

L'endospore bactérienne

L'endospore est une structure facultative, qui se forme à l’intérieur de certaines bactéries à Gram

positif (genres  BacillusClostridium et  Plectridium)  lorsque  les  conditions  de  vie  sont  défavorables.

L’aspect de la spore incluse dans le bacille (endospore) aide à identifier l’espèce.
On notera les caractéristiques suivantes : forme, position, déformation du corps végétatif

Classification spores

 

 

DOCUMENT 3 

Gélose à l'amidon - Recherche de l’hydrolyse de l’amidon

 

INTRODUCTION ET OBJET DU TEST

Les bactéries qui produisent une amylase sont capables d’hydrolyser l’amidon (incorporé à raison de 1% (m/V) dans une base de gélose nutritive ordinaire) :

amidon === amylase ===> maltose 

TECHNIQUE & LECTURE

Ensemencer par une strie longitudinale à la surface du milieu. Incuber à la température désirée.
Quand la culture est suffisante, la mise en évidence de l’hydrolyse  de l’amidon se fait en recouvrant toute la gélose de lugol (eau iodée).
-  l’amidon donne une coloration bleu-violette, indiquant qu’il n’a pas été hydrolysé è amylase (-)
-  un halo clair autour de la culture indique une hydrolyse de l’amidon è amylase (+)

 

 

DOCUMENT 4

Caractères d'orientation des bacilles à Gram (+)

Orientation bacilles gram

 

 

 

DOCUMENT 5 

Caractères pour l'identification de quelques Bacillus

 

 

Mobilité

Type respiratoire

Croissance à 7% NaCl [1]

Hydrolyse de l’amidon

Spore

B. megaterium

V

AS

+

+

-Non déformante

-Ovale ou cylindrique

-Centrale ou terminale

B. cereus

+

AA

+

+

B. anthracis

-

AA

+

+

B. thuringiensis

+

AA

+

+

B. subtilis

+

AS

+

+

B. alvei

+

AA

-

+

-Déformante

-Ovale

-centrale ou terminale

B. brevis

+

AS

-

-

B. sphaericus

+

AS

V

-

-Déformante

-Ronde

-Subterminale ou terminale

AS : aérobie strict     AA : aéro-anaérobie

[1] Une croissance dans ce milieu indique un caractère halotolérant

 

2ème partie : étude de la thermorésistance des spores de la bactérie à identifier

Avec cette réalisation, tous les groupes de travaillent partent du même matériau : la suspension d'opacité équivalente à un étalon Mc Farland.

Plan etude thermoresistance spores

Résultats : bien que quelques contaminants soient présents, il est possible de dénombrer, sur la plupart des boites, le nombres de colonies.

Pour l'inoculum non chauffé : les colonies sont dues à la présence des formes végétatives

Pour l'inoculum chauffé : les colonies sont dues aux spores qui ont été activées par le choc thermique, les formes végétatives ayant été détruites par la chaleur

Thermorsistance bacillus thuringiensis b

 

En savoir plus : http://www.gerbeaud.com/jardin/decouverte/bacillus-thuringiensis.php 

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Date de dernière mise à jour : 21/04/2018