Bière : Cytométrie directe de levures en cellule de Malassez

Préambule : les informations, valeurs, tableaux, graphes et questions présentées ci-dessous ne sont qu'une partie du sujet étudiée.
Certaines questions ne figurent pas dans le document support de l'activité mais ont été posées au cours des séances.

 

La fabrication de la bière (qui peut être réalisée de façon artisanale à domicile) nécessite une fermentation efficace. La préculture (quantité de levures nécessaire pour ensemencer le moût -jus n’ayant pas été fermenté- destiné à la fermentation) de la levure (ici Saccharomyces cerevisiae) joue un rôle essentiel dans ce processus.

Dans le but d’ensemencer sa cuve de fermentation, une brasserie artisanale prépare une préculture de levures.
Pour que la fermentation soit efficace, la préculture doit être suffisamment concentrée en levures : entre 1 à 2.•106 levures vivantes.mL-1.

 

1ère partie : présentation de la cellule (ou hématimètre) de Malassez

Utilisé pour le comptage de  cellules (animales, végétales, fungiques) en suspension dans un liquide (à l’origine, pour le comptage des cellules sanguines, d’où son nom), l'hématimètre de Malassez est une épaisse lame de verre creusée de rigoles qui délimitent des plates-formes :

  • 2 plates-formes latérales surélevées qui supportent une lamelle en verre, épaisse et plane : la lamelle hématimétrique ;
  • 1 plate-forme centrale légèrement abaissée sur laquelle est gravé un quadrillage.

Cellules malassez 4

 

Image 3d hematimetre

 

  • Entre la lamelle et la plate-forme centrale est créée une cavité qui recevra la suspension.
  • La distance (lamelle/plate-forme) définit la profondeur (P) connue de l’hématimètre
  • Le quadrillage de la plate-forme centrale a une surface précise et connue (S)
  • Le volume (V) de suspension dans lequel les cellules sont comptées est donc : V  = p  x  S

Caracteristiques malassez 2

 

Exemple de remplissage d'un cellule de Malassez à 2 chambres de comptage :

Hematimetre rempli

 

Hematimetre rempli 2

Ne pas oublier que l'exposition à la source de lumière du microscope provoque un échauffement et donc une évaporation du liquide contenu dans la chambre hématimétrique.
Le volume de celle-ci étant très faible, le comptage doit être rapide, sans quoi la diminution du volume va entrainer une erreur importante du comptage.

 

Démonstration en vidéo 

 

2ème partie : dénombrement des levures vivantes par cytométrie directe

Pour vérifier la viabilité des levures de la préculture, procéder ainsi :

  • Homogénéiser soigneusement la préculture.
  • Dans un tube Eppendorf, introduire à la pipette à piston 100 µL de préculture et 100 µL de bleu de méthylène de Funk
  • Homogénéiser doucement et soigneusement.

Donnée : Le bleu de méthylène de Funk est une solution colorante vitale. Les cellules vivantes rejettent ce colorant, les cellules mortes le gardent.

  • Remplir la cellule de Malassez avec la suspension réalisée 
  • Placer la cellule de Malassez sur la platine du microscope et laisser sédimenter 5 minutes.
  • Vérifier l’homogénéité de la répartition à l’objectif x 10 
  • Effectuer la numération (compter au moins 200 cellules) en comptant d’une part  les cellules vivantes et d’autre part les cellules mortes, en dénombrant sur des rectangles situés aux quatre coins opposés du quadrillage, puis éventuellement sur d’autres rectangles éloignés des précédents.

Levures coloration vitale malassez

 

  1. Déterminer le facteur de dilution Fd de la préculture en présence du bleu de Funk.
  2. Présenter les valeurs mesurées du comptage dans un tableau indiquant :
    - pour chaque unité de comptage, le nombre de levures vivantes et le nombre de levures mortes
    -  le nombre total de levure vivantes et mortes.

Denombrement levures cytometrie directe

  1. Calculer le pourcentage de levures vivantes.
  2. Déterminer CN (levures vivantes ; préculture) : la concentration en nombre de levures vivantes par mL-1 de préculture  en tenant compte du facteur de dilution.
    ( établir l’équation aux grandeurs, aux unités, et aux valeurs numériques).
  3. Conclure sur l’utilisation ou non de cette préculture pour mener à bien la fermentation.
    (rechercher l’information nécessaire dans le contexte)

 

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Date de dernière mise à jour : 27/02/2017

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